Скрининг геномных модификаций: метод идентификации мутантов, сгенерированных CRISPR, у дрозофил

- Когда введенные эмбрионы разовьются во взрослых особей G0, скрещивайте всех отдельных мух с подходящими балансирными запасами, чтобы расширить потенциальные отредактированные линии F1 CRISPR и иметь возможность отслеживать наследование геномной модификации. Затем скрестите случайно выбранных одиночных самцов F1 с подходящими самками-балансирами, чтобы иметь возможность восстановить потомство, если самец F1 окажется положительным на мутацию. После того, как крест приживется, переложите самца F1 в трубку для скрининга.

Чтобы извлечь геномную ДНК, раздавите муху с помощью наконечника пипетки, содержащего буфер для экстракции. Как только ткань будет разрушена, вытолкните жидкость. Экстракционный буфер содержит протеиназу К, фермент, который переваривает белки в образце и инактивируется при высокой температуре.

Теперь, когда ДНК доступна, приступайте к ПЦР-скринингу. Например, используйте праймеры, предназначенные для амплификации области, содержащей новую последовательность. Только при наличии модификации происходит связывание второго праймера и амплификация продукта ПЦР. В этом примере мы увидим, как мух разводят и проверяют с помощью ПЦР на предмет вставки трансактивационной послед