Подготовка филе личинок: метод визуализации интактных сенсорных нейронов и ассоциированных клеток эпидермиса

- Чтобы сориентировать личинку для вскрытия филе, поместите ее в посуду с силиконовым покрытием, содержащую холодный физиологический раствор, и определите ее спинную и брюшную стороны. Трахейные трубки, проходящие по его длине, обозначают дорсальную сторону, в то время как брюшные зубчатые пояса определяют вентральную сторону.

Затем брюшной стороной вверх аккуратно растяните личинку и приколите каждый конец к дну посуды. Такое положение позволит сохранить дорсальные кластеры сенсорных мультидендритных нейронов и связанные с ними эпидермальные клетки нетронутыми по мере вскрытия.

С помощью препарирующих ножниц разрежьте вдоль вентральной средней линии личинки. Приколите кутикулу к пластине, чтобы сделать препарат более плоским, и удалите внутренние структуры, чтобы выявить подлежащую мышечную ткань. Затем осторожно удалите соответствующую мышцу, чтобы обнажить эпидермис и получить доступ к ранее скрытым нейронам, сохраняя при этом их дендритную морфологию.

В примере протокола мы увидим подробную демонстрацию подготовки филе личинок и удаления мышц для просмотра сенсорных нейронов и эпидермальных клеток.

- Для начала добавьте достаточно холодного солевого раствора в форму с силиконовым эластомером, чтобы покрыть нижнюю поверхность. Добавьте личинку субъекта в чашку и поместите ее под стереомикроскоп, обеспечив правильное размещение света. Расположите личинку вентральной стороной вверх, которую можно определить по поясам брюшных зубцов.

Вытяните личинку в передне-заднем направлении, и с помощью булавок от насекомых приколите голову и хвост ко дну блюда. Парой тонких ножниц для препарирования разрежьте вдоль вентральной средней линии личинки от одного конца до другого. Расправьте личинку и приколите ткань кутикулы по четырем углам, чтобы она лежала ровно.

С помощью щипцов удалите внутренние органы, в том числе ЦНС, кишку и трахею. Отрегулируйте шпильки от насекомых так, чтобы филе было натянутым, но не максимально растянутым.

Найдите дорсальную среднюю линию личинки, где отсутствует мышечная ткань, а затем расположите зубец щипца внутри этой границы. Проведите зубец между мышцей и эпидермисом, стараясь свести к минимуму контакт с эпидермисом.

- Чтобы свести к минимуму повреждение эпидермиса, рассекайте его как можно более плоскими зубцами. И попробуйте рассекать в кальцийсодержащем физрастворе. Это может помочь создать пространство между мышцей и эпидермисом.

- Далее потяните щипцы вверх, чтобы разорвать крепление мышцы к стенке тела в одной опорной точке. Повторите этот процесс для остальных интересующих сегментов мышц.

Перенастройте загоны для насекомых, чтобы максимально растянуть филе личинок во все стороны.