Вскрытие личиночных лимфатических желез: выделение органа, продуцирующего гемоциты дрозофилы

- Личиночная лимфатическая железа Drosophila melanogaster отвечает за выработку гемоцитов, или клеток крови, которые циркулируют в личиночной гемолимфе. Чтобы определить лимфатическую железу, сначала найдите дорсальный сосуд или сердце, которое перекачивает гемолимфу по всему телу. Следуйте по дорсальному сосуду к голове, пока не найдете мозг. Лимфатическая железа представляет собой небольшую многолопастную структуру, расположенную рядом с мозгом, по бокам от дорсального сосуда.

Чтобы найти первичную долю, определите самую большую долю железы. Эта доля содержит три зоны, определяемые разными стадиями развития гемоцитов. Ближайшая к дорсальному сосуду медуллярная зона содержит незрелые гемоциты, в то время как корковая зона содержит зрелые гемоциты. На заднем конце первичной доли вы можете найти задний сигнальный центр, состоящий из специализированных гемоцитов. Вторичные и третичные доли меньше по размеру и не имеют определенных зон.

Чтобы вскрыть лимфатическую железу, вам понадобится препарирующий микроскоп, два щипца для манипуляций с личинками и буферный солевой раствор.

В этом примере мы будем препарировать лимфатические узлы для использования в иммуногистохимии.

- Чтобы начать диссекцию лимфатических желез, добавьте 1 миллилитр 1x PBS в 1 лунку 24-луночного планшета для каждой экспериментальной установки, которую необходимо рассечь. Затем с помощью одноразовой переводной пипетки добавьте по 1 капле 0,1% PBST в каждую лунку. Поставьте тарелку на лед. Положите чистую препарирующую прокладку на подсвеченное основание стереомикроскопа. С помощью одноразовой переводной пипетки нанесите каплю 0,01% PBST на подушечку.

Перенесите личинку в каплю PBST для вскрытия. Удерживайте лаву одной парой щипцов тыльной стороной вверх, примерно на 1/4 длины от заднего конца. С помощью второй пары щипцов захватите кутикулу непосредственно перед первой парой и осторожно потяните личиночную кутикулу к передней части, пока не обнажаются крючки для рта.

Освободите кутикулу и с помощью обоих щипцов рассеките личинку пополам. Удалите задний конец из капли PBST и выбросьте. Прижмите кутикулу для устойчивости, а затем с помощью второй пары щипцов захватите открытые крючки для рта и осторожно вытащите их. Это отделит кутикулу от внутренних структур.

Держась за крючки для рта, осторожно удалите нежелательные структуры, такие как слюнные железы, жировое тело и кишечник. Аккуратно возьмите рассеченный тканевой комплекс за крючки для рта и перенесите его в лунку пластины на льду. Повторите вскрытие с таким количеством личинок, которое необходимо, но не превышайте 30-минутное время вскрытия, прежде чем переходить к этапу фиксации.

Чтобы начать крепление ткани, поместите каплю монтажного буфера на предметное стекло. Используя крючки для рта в качестве ручки, перенесите лимфатическую железу в буферную каплю. Равномерно распределите ткани, распределяя при этом монтажный буфер.

Осторожно проведите один щипец под тыльный сосуд, осторожно потянув к периферии крепежного буфера, чтобы вытянуть и сплющить лимфатическую железу. Пилящими движениями разрежьте дорсальный сосуд между лимфатической железой и мозгом. Переместите остальные ткани от лимфатической железы к самому внешнему краю буфера.

Возьмите чистый защитный листок и осторожно опустите его на монтажный буфер. Теперь предметные стекла готовы к визуализации или могут храниться при температуре 4 градуса Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся.