Механическое удаление мембраны хориона и вителлина: метод подготовки ооцитов дрозофилы к прямому наблюдению

- Начните со зрелых яйцеклеток из неподвижных яичников в физиологическом растворе. Зрелые ооциты несут яичную скорлупу, состоящую из наружного хориона и внутренней вителлиновой мембраны.

Чтобы механически удалить хорион и вителлиновую мембрану, поместите ооциты между матовыми частями двух предварительно обработанных предметных стекол. Перемещайте верхнюю горку прямыми движениями вперед-назад, чтобы создать трение, которое сворачивает ооциты.

Теперь переместите верхнюю горку под небольшим углом, чтобы свернуть ооциты в другом направлении. Избегая кругового движения, увеличивайте этот угол с короткими шагами, пока верхняя горка не переместится перпендикулярно нижнему слайду. Это движение механически удаляет хорионы и вителлиновые мембраны, обеспечивая доступ зондов или красителей к ооциту.

Ооциты без хорионов будут казаться длинными и тонкими, а без вителлиновых мембран будут иметь заостренные концы. Чтобы отделить очищенные ооциты от окружающего мусора, перенесите смесь образцов в пробирку и дайте ооцитам осесть на дно, в то время как мусор будет плавать наверху и может быть удален.

В этом протоколе мы удалим мембраны хориона и вителлина из зрелых ооцитов дрозофилы.

- Чтобы отделить ооциты поздней стадии, сначала добавьте 1 миллилитр PBSBTx в неглубокую чашку для препарирования. Затем используйте P200 с наконечником с покрытием BSA, чтобы перенести неподвижные яичники в неглубокую миску. Пипетируйте яичники вверх и вниз с помощью наконечника пипетки, покрытого BSA, чтобы вытеснить зрелые ооциты из менее зрелых ооцитов.

Когда ооциты поздней стадии достаточно разделены, перенесите всю ткань в микропробирку объемом 500 микролитров. Удалите лишнюю жидкость с помощью вытянутой пастеровской пипетки, оставив в пробирке от 150 до 200 микролитров.

Чтобы подготовиться к скручиванию ооцитов, предварительно смочите глубокую посуду 200 микролитрами PBSBTx. Накройте блюдо крышкой и отставьте его в сторону.

Возьмите три предметных стекла из матового стекла и отложите три предметных стекла в сторону. Затем аккуратно потрите матовое стекло областей слайдов один и два вместе. Промойте их в деионизированной воде, чтобы удалить осколки стекла, и высушите одноразовой салфеткой. Смажьте матовые участки первого и второго слайдов PBSBTx, добавив 50 микролитров PBSBTx в один слайд и протерев этот участок другим слайдом. Удалите жидкость с помощью одноразовой салфетки и поместите предметные стекла под препарирующий микроскоп. Держите матовые участки первого и второго слайдов в контакте с третьим слайдом, поддерживающим второй слайд.

Чтобы свернуть ооциты, сначала смочите наконечник пипетки P200 в PBSBTx и диспергируйте ооциты в микрофугальной пробирке путем пипетирования вверх и вниз. Перенесите 50 микролитров жидкости, содержащей ооциты, в центр матовой стеклянной части предметного стекла. Для этого поднимите вторую горку.

Медленно опускайте слайд два, пока поверхностное натяжение жидкости не создаст уплотнение между двумя областями матового стекла. Жидкости должно быть достаточно, чтобы покрыть покрытый инеем участок, но она не должна просачиваться. Затем удерживайте нижний слайд на месте одной рукой, а другой рукой перемещайте верхний слайд два назад и вперед в горизонтальном направлении, удерживая слайд два на одном уровне и опираясь на слайд три.

Выполняйте под микроскопом для легкой визуализации движения и прогресса ооцитов. После нескольких движений в горизонтальном направлении немного измените угол движения. С несколькими шагами постепенно увеличивайте этот угол до 90 градусов, пока движение второго верхнего слайда не станет перпендикулярным начальному направлению. Обратите внимание, что в жидкости будут видны пустые хорионы, а ооциты, лишенные хорионов, будут казаться длиннее и тоньше.

- При перекате ооцитов следите за тем, чтобы направление перекатывания всегда было прямолинейным и никогда не было круговым.

- Повторите раскатывание от 7 до 10 раз, пока раствор не станет слегка мутным. Прекратите сворачивание, когда большинство ооцитов потеряют свои вителлиновые мембраны.

Аккуратно поднимите верхнюю горку два, перетащив один из ее углов к центру матовой области на нижней горке одну, чтобы свернутые ооциты скапливались в центре матовой области. Промойте ооциты с обоих предметных стекол с помощью PBSBTx в глубокой чашке, содержащей PBSBTx.

Очистите первую и вторую горки сверхчистой водой. Высушите одноразовой салфеткой и сбросьте. Повторяйте эти действия до тех пор, пока не будут свернуты все ооциты одного и того же генотипа. Обычно для этого требуется три-четыре раунда перекатывания на каждый генотип.

Чтобы удалить мусор после прокатки, добавьте 1 миллилитр PBSBTx в 15-миллилитровую коническую трубку. Взболтайте жидкость, чтобы покрыть боковые стороны трубки. С помощью наконечника пипетки P1000 с покрытием PBSBTx перенесите свернутые ооциты из глубокой чашки в коническую трубку, содержащую 1 миллилитр PBSBTx. Добавьте еще 2 миллилитра PBSBTx в коническую трубку, содержащую ооциты.

Держите коническую трубку на темном фоне, чтобы увидеть непрозрачные ооциты, когда они опускаются. После того, как ооциты осядут на дно, используйте P1000, чтобы удалить верхние 2 миллилитра раствора, содержащего мусор, и выбросьте их.

Повторив этот шаг в течение трех раундов удаления мусора, используйте наконечник пипетки P1000 с покрытием PBSBTx для переноса ооцитов обратно в исходную микропробирку объемом 500 микролитров. От 20 до 25 самок должны получить примерно 50 микролитров свернутых зрелых ооцитов.