Нарушение кутикулы: метод сбора гемолимфы из личинок дрозофил

- Для начала нанесите каплю буфера на чистую диск для препарирования. Затем поместите на каплю высушенную живую личинку. Дрозофила, как и другие членистоногие, имеет открытую кровеносную систему, в которой сердце перекачивает гемолимфу по всему телу, омывая внутренние органы. Чтобы освободить гемолимфу, которая представляет собой объединенную кровь и межтканевую жидкость членистоногих, используют щипцы и вскрывают кутикулу, полужесткую наружную оболочку личинок.

Затем выбросьте тушу и перенесите раствор гемолимфы из препарирующей пластины в охлажденный буферный раствор в микроцентрифужной пробирке. Наконец, используйте гемоцитометр для подсчета количества собранных гемоцитов, клеток гемолимфы. В этом протоколе мы будем собирать гемолимфу от личинок Drosophila melanogaster.

- Начните сбор гемолимфы, добавив 10 микролитров 1x PBS в микроцентрифужную пробирку и положив пробирку на лед. Затем нанесите каплю 10 микролитров 1x PBS на чистую диск для препарирования. Выберите отдельную личинку, и высушите ее, положив на тканевую салфетку. Затем перенесите его в каплю PBS на диск для препарирования.

С помощью щипцов аккуратно разорвите и переверните кутикулу, чтобы освободить гемолимфу, а затем выбросьте тушку. С помощью пипетки соберите гемолимфу с рассекающей подушечки. Добавьте гемолимфу в пробирку микроцентрифуги PBS со льдом и перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Загрузите 10 микролитров образца в камеру гемоцитометра и снимите показания концентрации.