дрозофила Поздняя диссекция куколки с помощью непрямой мышцы полета (IFM): метод высокопроизводительного сбора тканей

- У взрослой мухи мышцы непрямого полета, или ИФМ, являются самыми большими мышцами мухи, охватывающими всю грудную клетку. IFM управляют характерными высокочастотными движениями крыльев у двукрылых мух, включая дрозофилу. Две противоположные группы мышечных волокон составляют ИФМ.

Во-первых, дорсальные продольные мышцы, или ДЛМ, расположены вдоль срединной плоскости грудной клетки над кишкой и простираются от передней к задней. Во-вторых, дорсальные вентральные мышцы, или DVM, простираются от верхней до нижней части грудной клетки и окружены TDT, или прыгающей мышцей. Обе группы мышц прикрепляются к кутикуле.

Примерно через 48 часов после образования пупария, или APF, созревающие IFM могут быть визуально идентифицированы с помощью простого диссекционного микроскопа. В примере протокола мы будем собирать IFM от куколок старше 48 часов APF для анализа с высокой пропускной способностью.

- Для вскрытия IFM через 48 часов APF используйте слегка смоченную малярную кисть, чтобы перенести этапированные куколки на полосу двустороннего липкого скотча, прикрепленную к предметному стеклу микроскопа. Расположите куколок в линию, вентральной стороной вниз и спереди к нижней части предметного стекла. Когда все куколки будут размещены, используйте щипцы, чтобы раздразнить и открыть первую куколку над передними дыхальцами, а затем осторожно сдвинуть пару щипцов дорсально к задней части, разрезая куколку по мере движения щипцов.

Освободите куколку от вскрытого футляра, и сразу же перенесите куколку в каплю PBS на предметное стекло второго микроскопа. Когда все куколки будут освобождены, с помощью тонких ножниц отрежьте брюшную полость куколок от грудной клетки и сгруппируйте брюшную полость в отдельную кучу. Когда все грудные клетки будут удалены, используйте лист папиросной бумаги, чтобы удалить большую часть PBS и кучу брюшной полости.

Добавьте каплю свежего охлажденного PBS к оставшимся грудным клеткам, прежде чем с помощью ножниц разрезать от головы вдоль продольной оси тела одним движением, чтобы разделить грудную клетку пополам. Когда все куколки будут рассечены, используйте щипцы номер пять, чтобы выбрать одну из полусекций, и осторожно введите кончики одного щипца выше и ниже середины ИФМ.

Удерживая первую пару щипцов неподвижно, с помощью тонких ножниц отрежьте один конец IFM от кутикулы и сухожилий, прежде чем повернуть куколку на 180 градусов, чтобы другой конец IFM был отрезан от кутикулы и сухожилий. С помощью щипцов перенесите пучок IFM из грудной клетки к краю пузыря PBS, используя натяжение воды, чтобы удерживать пучок на месте.

Затем сдвиньте тушу на противоположную сторону предметного стекла и таким же образом рассеките остальные ИФМ. Когда все IFM будут собраны, используйте щипцы номер пять, чтобы удалить любые прыгающие мышцы или фрагменты кутикулы, которые могли попасть в образцы. Затем с помощью натяжения воды аккуратно захватите рассеченные ИФМ между парой щипцов и поместите ИФМ в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 250 микролитров охлажденного PBS.