Энциклопедия экспериментов JoVE
Биология
0 просмотров • 2:59 мин. • April 30th, 2023
- В пробирке, содержащей буфер М9, собрать до 150 червей-гермафродитов на нужной стадии развития. Удалите бактерии из червей путем промывки буфером M9 и центрифугирования образца.
Просмотрите пробирку под препарирующим микроскопом при удалении надосадочной жидкости, чтобы предотвратить потерю образца. Переложите червей в стеклянную посуду с минимальным объемом буфера M9. Добавьте левамизол для обезболивания глистов.
Найдите голову червя и глотку, или переднюю кишку, которая содержит две луковицевидные структуры. С помощью двух иголок прорезал червя за глоткой. Убедитесь, что вы завершили диссекцию быстро, чтобы не затронуть ткани.
Как только кутикула нарушается, два плеча гонады выдавливаются или выталкиваются из тела из-за внутреннего давления червя.
В этом примере мы будем препарировать гонады взрослых червей для иммунофлуоресцентного анализа.
- Выберите от 100 до 150 червей на желаемой стадии развития и соберите их в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 100 микролитров буфера M9. Затем заполните микроцентрифужную пробирку еще 900 микролитрами буфера M9 и центрифугируйте его в 1000 раз больше g в течение 1 минуты при комнатной температуре.
Под препарирующим микроскопом аккуратно извлеките 900 микролитров буфера М9. Затем повторите промывку еще два раза, чтобы удалить большую часть прикрепленных бактерий.
Затем с помощью 200-микролитрового наконечника для микропипетки с расширенным отверстием перенесите червей в 100 микролитрах буфера M9 в стеклянную чашку для часов с плоским дном. Затем добавьте в блюдо от 1 до 3 микролитров 0,1 молярного левамизола и аккуратно взболтайте его. Теперь прикрепите две иглы 25-го калибра к двум шприцам, чтобы сделать по одному инструменту для препарирования на каждую руку.
Под микроскопом для препарирования поместите каждую иглу под каждым червем и над ним и сделайте тонкий надрез на каждом червячке рядом со второй глоточной луковицей, используя движение, подобное ножницам. Обрежьте всех животных по крайней мере один раз в течение пяти минут, чтобы левамизол оставался эффективным.
- Очень важно, чтобы вскрытие животных в чашке было завершено менее чем за пять минут.
- Если выдавленная гонада не видна, просто пропустите это животное. Здесь видны правильные экструдированные половые железы.