ПЦР с одним червем: метод извлечения и амплификации геномной ДНК

- Для ПЦР-анализа на одного червя позвольте червю-гермафродиту самооплодотвориться и отложить яйца, которые произведут генетически идентичное потомство и, следовательно, сохранят копию модифицированного штамма. Затем перенесите родительский материал в пробирку, содержащую буфер для лизиса червей.

Заморозьте тюбик при температуре минус 80 градусов по Цельсию, чтобы разорвать кутикулу или внешний слой. Нагрейте образец до плюс 60 градусов Цельсия, чтобы лизировать клетки червей, высвобождая внутриклеточные белки вместе с геномной ДНК клетки. При такой температуре протеиназа К в буфере разрушает белки, особенно нуклеазы, которые в противном случае разрушили бы геномную ДНК.

Затем увеличьте температуру до 95 градусов по Цельсию, чтобы инактивировать фермент. Наконец, добавьте лизат клеток в пробирку с мастер-смесью для ПЦР, состоящей из реакционного буфера, dNTP, прямых и обратных праймеров для интересующей области, taq-полимеразы и воды, доводя реакцию до желаемого конечного объема. Чтобы провести ПЦР, запустите соответствующую программу термоамплификатора, которая амплифицирует интересующий участок ДНК.

В следующем примере мы рассмотрим процедуру ПЦР для скрининга событий редактирова