Диссоциация одиночных клеток Caenorhabditis elegans: метод выделения живых клеток

- Начните с промытых гранулированных червей и добавьте буфер для лизиса, содержащий SDS, моющее средство, и DTT, восстановитель. Это разрушает защитную кутикулу червя, обнажая тело для диссоциации клеток. Избегайте длительного воздействия буфера для лизиса, чтобы свести к минимуму лизис и гибель клеток.

Далее удалите лизисные реагенты с помощью нескольких промывок холодного изоляционного буфера. Важно, чтобы этот буфер имел правильную осмолярность, чтобы предотвратить гибель клеток. Используйте фермент протеаза для разрушения межклеточных соединений. Помогите процессу гомогенизации вместе с механической энергией, пипетируя смесь к стенке трубки.

Добавьте среду, содержащую сыворотку, чтобы остановить ферментную реакцию, и антибиотики, чтобы предотвратить загрязнение. Гранулируйте и промойте пробу несколько раз, чтобы удалить большую часть мусора.

Наконец, поместите трубку на лед, чтобы обеспечить осаждение под действием силы тяжести. Мусор, включая остатки кутикулы или скопления клеток, будет оседать, в то время как диссоциированные клетки останутся во взвешенном состоянии в верхнем слое среды. Эти клетки могут быть использованы для краткосрочного культивирования или для выделения о