Диссоциация одиночных клеток Caenorhabditis elegans: метод выделения живых клеток

- Начните с промытых гранулированных червей и добавьте буфер для лизиса, содержащий SDS, моющее средство, и DTT, восстановитель. Это разрушает защитную кутикулу червя, обнажая тело для диссоциации клеток. Избегайте длительного воздействия буфера для лизиса, чтобы свести к минимуму лизис и гибель клеток.

Далее удалите лизисные реагенты с помощью нескольких промывок холодного изоляционного буфера. Важно, чтобы этот буфер имел правильную осмолярность, чтобы предотвратить гибель клеток. Используйте фермент протеаза для разрушения межклеточных соединений. Помогите процессу гомогенизации вместе с механической энергией, пипетируя смесь к стенке трубки.

Добавьте среду, содержащую сыворотку, чтобы остановить ферментную реакцию, и антибиотики, чтобы предотвратить загрязнение. Гранулируйте и промойте пробу несколько раз, чтобы удалить большую часть мусора.

Наконец, поместите трубку на лед, чтобы обеспечить осаждение под действием силы тяжести. Мусор, включая остатки кутикулы или скопления клеток, будет оседать, в то время как диссоциированные клетки останутся во взвешенном состоянии в верхнем слое среды. Эти клетки могут быть использованы для краткосрочного культивирования или для выделения определенных клеточных популяций с помощью FACS или иммунопреципитации.

В примере протокола мы будем диссоциировать трансгенных червей, экспрессирующих GFP, в нейронах, представляющих интерес, чтобы изолировать и проанализировать эти клетки.

- После сбора животных центрифугируйте их при 1 600 перегрузках g в течение пяти минут. Удалите всю надосадочную жидкость и снова суспендируйте червей в 1 миллилитре среды М9. Переложите суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Центрифугируйте при 1 600 умноженных на г в течение пяти минут, чтобы измельчить червей. Затем добавьте 200 микролитров буфера SDS-DDT и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Теперь черви должны казаться морщинистыми вдоль тела, если смотреть на них под световым микроскопом.

Затем добавьте 800 микролитров ледяного изоляционного буфера и перемешайте, осторожно щелкнув тюбиком. Центрифугируйте при 13 000 умноженных на g и 4 градусах Цельсия в течение одной минуты, чтобы измельчить червей. Удалите надосадочную жидкость и промойте 1 миллилитром изоляционного буфера.

Повторите процесс центрифугирования и промывки в общей сложности пять раз, каждый раз тщательно удаляя изоляционный буфер. После этого добавьте в гранулу 100 микролитров протеазной смеси из Streptomyces griseus, растворенной в изоляционном буфере.

Выдерживать при комнатной температуре от 10 до 15 минут. Убедитесь, что вы применяете механическое разрушение, пипетируя вверх и вниз от 60 до 70 раз наконечником микропипетки объемом 200 микролитров к дну пробирки. Чтобы определить стадию пищеварения, удалите от 1 до 5 микролитров смеси для пищеварения, опустите ее на предметное стекло и осмотрите с помощью микроскопа для тканевых культур.

Через пять-семь минут фрагменты червей должны заметно уменьшить кутикулу, и будет хорошо видна суспензия клеток. Остановите реакцию, добавив 900 микролитров коммерчески доступной среды L15 Лейбовица с добавлением 10% FBS и пенициллин-стрептомицина.

Центрифугируйте при 10 000 умноженных на g и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут для гранулирования изолированных фрагментов и клеток. Гранулированные ячейки еще дважды промыть холодным наполнителем с добавлением L15 из расчета 1 миллилитр средства на одну промывку. Повторно суспендируйте гранулированные клетки в 1 миллилитре дополненной среды L15 и оставьте на льду на 30 минут.

Затем возьмите верхний слой, который составляет примерно от 700 до 800 микролитров, и переложите его в микроцентрифужную пробирку. Используйте автоматический счетчик клеток или гемоцитометр для измерения плотности клеток от 10 до 25 микролитров выделенных клеток.