Гальваническое покрытие РНК для кормления C. elegans: метод индуцирования экспрессии целевой дцРНК в E. coli
JoVE Encyclopedia of Experiments
Биология
0 просмотров • 3:24 мин • April 30th, 2023
- У C. elegans РНК-интерференция может быть индуцирована кормлением червей бактериями, экспрессирующими двухцепочечную РНК или дцРНК из рекомбинантной ДНК-плазмиды.
Для начала выращивайте устойчивый к тетрациклину HT115 E. coli, трансфицированный плазмидой L4440, в течение ночи на селективных агаровых планшетах LB, содержащих тетрациклин и ампициллин или его функциональный аналог карбенициллин. В дополнение к целевой ДНК, плазмида содержит ген устойчивости к ампициллину. Только колонии бактерий, которые наследуют плазмиду, могут расти в присутствии этих антибиотиков.
Далее соберите колонии бактерий и разложите их в жидкой среде LB до нужной концентрации. Чтобы вызвать экспрессию дцРНК, перенесите раствор бактерий на подготовленную среду для роста нематод, или NGM, агаровые пластины, содержащие IPTG.
В этой системе экспрессии ИПТГ имитирует лактозу, инактивируя лак-репрессор, обеспечивая экспрессию Т7-РНК-полимеразы. На плазмиде экспрессия целевой ДНК регулируется двумя сходящимися промоторами Т7. Следовательно, смысловые и антисмысловые последовательности транскрибируются, что приводит к экспрессии дцРНК.
Наконец, червь использует информацию о последовательностях из проглоченной дцРНК для подавления эндогенных мРНК комплементарными последовательностями. В этом эксперименте мы приготовим РНК-интерференционные пластины с трансгенной кишечной палочкой для кормления C. elegans.
- Для планшетов с РНК-интерференцией загрузите 6-сантиметровые пластины агаром NGM, содержащим IPTG и карбенициллин. Дайте им высохнуть от 24 до 48 часов при комнатной температуре в темноте. Затем перенесите их на 4 градуса Цельсия на срок до 14 дней.
Затем селективные планшеты, содержащие карбенициллин и тетрациклин, содержат клоны РНК-интерференцированных бактерий с плазмидой L4440, несущей ген lin-53. Используйте трехфазный шаблон полос и убедитесь, что на нем установлен пустой векторный регулятор. Затем вырастите пластины в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.
На следующий день выберите не менее трех одиночных колоний и инокулируйте каждую из них в отдельную культуральную пробирку 2 миллилитрами LB с добавлением карбенициллина, но не тетрациклина. Планируйте проведение трех здоровых культур для каждого состояния.
Затем выращивайте культуры в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию, пока они не достигнут оптической плотности на уровне 600 нанометров от 0,6 до 0,8. Затем добавьте по 500 микролитров каждой бактериальной культуры в 6-сантиметровую пластину NGM агаровой РНК-интерференции. Инкубируйте пластины в течение ночи при комнатной температуре в темноте.
Обзор
В данной статье описывается метод индуцирования РНК-интерференции (РНКi) у C. elegans с использованием бактерий, экспрессирующих двухцепочечную РНК (дцРНК). Протокол включает подготовку планшетов для РНКi с трансгенными E. coli и скармливание их червям для снижения уровня экспрессии целевых мРНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генетика
- Молекулярная биология
Теоретические основы
- C. elegans является модельным организмом, широко используемым в генетических исследованиях.
- РНК-интерференция (РНКi) представляет собой мощный инструмент подавления экспрессии генов у различных организмов.
- Использование дцРНК позволяет эффективно воздействовать на специфические мРНК для их деградации.
- Трансгенные E. coli могут быть сконструированы для экспрессии дцРНК для проведения экспериментов по кормлению.
Цель исследования
- Продемонстрировать подготовку чашек с RNAi для кормления C. elegans.
- Проиллюстрировать процесс индуцирования RNAi посредством кормления бактериями.
- Предоставить подробный протокол для исследователей, заинтересованных в сайленсинге генов.
Используемые методы
- Культивирование тетрациклин-резистентного штамма E. coli HT115, содержащего плазмиду L4440.
- Приготовление чашек с агаром NGM, содержащим IPTG и карбенициллин.
- Посев клонов бактерий для РНК-интерференции на селективные чашки.
- Инокуляция культур и подготовка чашек с РНК-интерференционными бактериями для кормления.
Основные результаты
- Успешный рост E. coli, экспрессирующей dsRNA.
- Приготовление планшетов для RNAi, которые могут эффективно индуцировать сайленсинг генов.
- Демонстрация применимости метода для различных целевых генов.
- Разработка надежного протокола экспериментов по RNAi на C. elegans.
Выводы
- Описанный метод эффективен для индуцирования РНК-интерференции (RNAi) у C. elegans.
- Трансгенные E. coli могут использоваться в качестве источника дцРНК для скармливания.
- Данный протокол может помочь исследователям в изучении функций генов с помощью РНК-интерференции.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Скармливание РНК-интерференции (RNAi) C. elegans с использованием модифицированных E. coli обеспечивает быстрый и масштабируемый нокдаун генов для функциональной геномики и валидации мишеней на ранних этапах поиска. Данный подход способствует снижению механистических рисков, позволяя напрямую исследовать функцию генов в контексте всего организма. Этот метод находится на стыке валидации мишеней и разработки анализов, обеспечивая прогностическую уверенность для последующего скрининга и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Обеспечивает систематический нокдаун генов-кандидатов для выяснения биологических путей.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем установления связи между сайленсингом генов и фенотипическими результатами.
- Способствует механическому снижению рисков за счет изоляции ген-специфических эффектов in vivo.
- Предоставляет платформу для быстрой проверки гипотез на моделях, релевантных для конкретных заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных биологических систем для скрининга соединений и изучения генетических взаимодействий.
- Стандартизация условий нокдауна генов для получения воспроизводимых количественных результатов.
- Обеспечение масштабируемости и параллелизма рабочих процессов для подготовки к высокопроизводительному скринингу.
- Поддержка надежной оценки эффектов соединений на генетически определенных фонах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет исследования функций генов с моделями заболеваний для поиска трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от генетического открытия до доклинической валидации в системах целого организма.
- Снижает риски при принятии решений о дальнейшем продвижении за счет предоставления доказательств значимости мишени in vivo.
- Поддерживает прогностическое моделирование взаимодействий «ген-лекарство» в доступной для анализа системе.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод скармливания для РНК-интерференции интегрируется в непрерывный процесс исследований: от ранней валидации мишеней до разработки анализов и доклинического моделирования.
- Открывающая биология: Обеспечивает направленный сайленсинг генов для выяснения роли мишеней и биологических путей.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимый количественный нокдаун генов для надежной разработки анализов.
- Аналитика: Позволяет получать измеряемые фенотипические результаты для статистического сравнения различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает генетические открытия с доклиническими моделями для валидации биомаркеров и мишеней.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает стандартизированный, многократно используемый рабочий процесс для изучения функций генов в рамках нескольких программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при выборе мишени.
- Операционная ценность: предоставляет стандартизированные, масштабируемые и воспроизводимые протоколы нокдауна генов.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет раннего снижения биологических рисков.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение валидированных мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярной генетики и навыки работы с C. elegans.
- Необходим доступ к инфраструктуре для трансформации бактерий и селективного культивирования.
- Требуется межкомандная стандартизация подготовки планшетов для РНК-интерференции и бактериальной индукции.
- Может потребоваться адаптация для различных целевых генов или модельных штаммов.
- Практические ограничения включают вариабельную эффективность нокдауна и нецелевые эффекты.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс
Похожие видео
0 Просмотры
Протокол заразить
Похожие видео
0 Просмотры
Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans
Похожие видео
0 Просмотры
Осмотическое избежании в Caenorhabditis Элеганс: Synaptic функции двух генов, ортологов прав NRXN1 И NLGN1, В качестве кандидатов на аутизм
Похожие видео
0 Просмотры
Использование РНК-опосредованного вмешательства стратегии кормления для выявления генов, участвующих в размерах тела регулированию в Нематода
Похожие видео
0 Просмотры
Кормление РНК-интерференцией в жидкой культуре: высокопроизводительный метод подавления экспрессии генов у C. elegans
Похожие видео
0 Просмотры
Клеточная судьба перепрограммирования половых клеток нематоды в нейроны
Похожие видео
0 Просмотры
Крупномасштабная Нокдаун гена в
Похожие видео
0 Просмотры
Визуализация нейробласта Цитокинез Во
Похожие видео
0 Просмотры
Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026