Кормление РНК-интерференцией в жидкой культуре: высокопроизводительный метод подавления экспрессии генов у C. elegans

- Для начала добавьте карбенициллин и один миллимолярный IPTG в контрольные и тестовые культивальные колбы, содержащие S-базальную среду. В течение нескольких минут вращайте трубку, содержащую личинки первой стадии роста, также называемые личинками L1. Теперь снимите надосадочную жидкость и положите два микролитра L1 на агаровую пластину. Поместите пластину под препарирующий микроскоп и подсчитайте количество личинок.

Добавьте РНК-интерференционные бактерии, несущие неспецифическую РНК-интерференциальную плазмиду, в контрольную колбу и бактерии с генно-нацеленной РНК-интерференцией в тестовую колбу. Количество добавляемых бактерий должно быть пропорционально количеству червей.

Дайте личинкам расти при непрерывном встряхивании, чтобы обеспечить надлежащее насыщение кислородом. Личинки питаются бактериями. Внутри личинки маленькая интерферирующая РНК связывается с комплементарной мРНК, продуцируемой целевым геном, и подавляет экспрессию белка. Наконец, исследуйте червей на предмет интересующего вас фенотипа.

В примере протокола мы будем обрабатывать личинки L1 РНК-интерференцией, нацеленной на ген daf-2, в жидкой культуре.

- Чтобы начать лечение, добавьте 207,45 мл базальной среды S с дополнительными реагентами, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, в колбу для культуры Фернбаха объемом 2 800 миллилитров. Добавьте конечную концентрацию 50 мкг на миллилитр карбенициллина и 1 миллимоляр ИПТГ, и закройте колбу мембранной завинчивающейся крышкой.

Извлеките L1 из инкубатора с температурой 25 градусов Цельсия и переложите их в 15-миллилитровые пробирки. Центрифугируйте L1s при 1900 переданных g в течение трех минут. После отжима удалите надосадочную жидкость. Под микроскопом посчитайте L1 на два микролитра, и усредните числа, полученные по крайней мере из девяти капель.

Затем добавьте 50 000 червей для коллекции молодых червей и 100 000 червей для коллекции старых червей в четыре колбы для культуры Фернбаха, приготовленные на предыдущем этапе. Затем добавьте контрольные РНК-интерференционные бактерии и РНК-интерференционные бактерии для интересующего гена пропорционально количеству червей.

После добавления бактерий завершите посев червей базальным S, чтобы довести общий объем до 300 миллилитров. Инкубируйте культуру червей при температуре 25 градусов Цельсия в встряхивающем инкубаторе со скоростью 150 об/мин до сбора.