Микроинъекции живых эмбрионов дрозофилы: ранняя доставка реагентов развивающемуся эмбриону

- Соберите живые эмбрионы дрозофил и удалите их непрозрачные хорионы. Затем на стеклянный покровный лист нанесите линию гептанового клея, который представляет собой клей для ленты, растворенный в жидком гептане. Чтобы иметь возможность работать с уже дехорионированными эмбрионами, аккуратно выровняйте образцы в ряд на клее.

Перенесите покровное стекло в камеру обезвоживания, чтобы частично высушить эмбрионы. Это предотвратит утечку цитоплазмы во время или после инъекций. Затем снимите покровную крышку и накройте эмбрионы галоидоуглеродным маслом, чтобы предотвратить дальнейшее обезвоживание и в то же время позволить кислороду диффундировать в эмбрионы.

Для выполнения микроинъекции используйте систему микроинъекций на совместимом микроскопе. Глядя через кусочки глаз, определите как эмбрионы, так и иглу, предварительно загруженную раствором для инъекций. Разломайте иглу и убедитесь, что она дает однородные капли жидкости соответствующего размера. Затем введите иглу внутрь эмбриона и введите соответствующий объем. Достаньте иглу, и приступайте к следующей, повторяя инъекцию для оставшихся эмбрионов.

В примере протокола мы увидим демонстрацию микроинъекции эмбриона дрозофилы для исследований деления клеток в режиме реального времени.

- Перед тем как установить покровное стекло, сделайте гептановый клей, развернув двойную липкую ленту, и поместите ее в бутылку объемом 100 миллилитров. Добавьте около 50 миллилитров гептана, закупорьте бутылку и раскачивайте ее в течение нескольких дней.

Перед подготовкой эмбрионов сделайте камеру обезвоживания, в которую эмбрионы будут помещены перед инъекцией. Для этого поместите одну часть 35-миллиметровой посуды внутрь 100-миллиметровой чашки Петри, чтобы получился «стол». Добавьте дриерит, который представляет собой безводный сульфат кальция, вокруг него так, чтобы высота дриерита была не выше «стола», и накройте.

Чтобы начать подготовку эмбрионов, сначала соберите их из садки для кладки, меняя пластину виноградного сока с дрожжами каждый час. Эмбрионы должны быть визуализированы примерно через два часа после начала сбора. Чтобы подготовить покровное стекло, поместите его на одну сторону предметного стекла микроскопа и заклейте скотчем четыре угла вниз, чтобы он не двигался.

С помощью аппликатора с ватным наконечником нанесите один слой гептанового клея по линии на покровное стекло. Клей не должен быть вязким и должен высохнуть за несколько секунд. Если он слишком густой, добавьте еще гептана.

Наконец, наденьте кусок двойной липкой ленты на предметное стекло рядом с покровным стеклом. С помощью увлажненной щетки осторожно соберите эмбрионы с пластины для виноградного сока и поместите их на двойную липкую ленту на предметном стекле.

Затем используйте одну половину пинцета, чтобы прокатать эмбрионы по двойной липкой ленте, пока хорион не раскроется. Возьмите эмбрион, осторожно прокатав его по хориону, чтобы он прилип к пинцетру, и поместите его на гептановый клей на покровном листе длинной стороной эмбриона параллельно длинной стороне покровного стекла.

Поместите от 10 до 20 эмбрионов в один ряд. Снимите покровное стекло и поместите его в камеру обезвоживания на три-восемь минут. Время зависит от местной влажности и количества вводимого препарата. Далее поместите покровное стекло на металлическую камеру с вакуумной смазкой. Наконец, накройте эмбрионы галоидоуглеродным маслом, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания. Теперь эмбрионы готовы к инъекции.

Во-первых, найдите эмбрионы с целью 16X. Отодвиньте эмбрионы и найдите иглу, не перемещая фокальную плоскость. Центрируйте иглу и переместите ее вверх, не перемещая в направлении X или Y.

Чтобы открыть иглу, поместите край покровного стекла в поле зрения, а не туда, где будет игла, и опустите иглу в ту же фокальную плоскость. Очень осторожно перемещайте покровную крышку до тех пор, пока она не попадет в иглу и аккуратно не разломает ее. Переместите иглу вверх.

Теперь рассмотрим эмбрионы. Опустите иглу в масло и убедитесь, что из иглы получаются приятные жидкие капли. Постепенно переместите эмбрион в иглу, введите каплю в эмбрион, а затем переместите эмбрион. После того, как все эмбрионы были введены, они готовы к наблюдению на конфокальном микроскопе с объективом 60 или 100X.