Анализ температурного градиента: метод проверки температурных предпочтений у личинок дрозофил

- Чтобы проверить температурные предпочтения личинок дрозофилы, создайте температурный градиент, нагрев одну сторону алюминиевой пробной пластины и охладив другую. Алюминий обладает высокой теплопроводностью, что означает, что тепло передается эффективно, создавая стабильный линейный градиент температуры. После того, как система уравновесится, запишите температуру на пластине в температурных зонах одинакового размера, затем загрузите центр пластины чистыми личинками.

Закройте всю систему, чтобы устранить помехи от яркого света, и начните испытание. Личинки распространяются по градиенту, избегая слишком теплых или слишком холодных зон, и селятся в зонах благоприятных температур. Такое поведение называется термотаксисом. Чтобы оценить температурные предпочтения личинок, запишите количество животных в каждой температурной зоне.

В примере протокола мы увидим, как настроить однонаправленный градиент температуры между 18 и 28 градусами Цельсия и как обрабатываются личинки во время анализа.

- Чтобы подготовить однонаправленный градиент, сначала создайте влажную окружающую среду для анализа. Поместите два алюминиевых блока, соединенных в отдельные водяные бани, на влажные бумажные полотенца на расстоянии 10 сантиметров друг от друга. Водяные бани нужно заранее прогреть. Далее вносят 100 миллилитров 1% агарозы и добавляют по 25 миллилитров в каждую пробирную пластину на ровной поверхности. Как только агароза застынет, аккуратно потрите поверхность меламиновой губкой, чтобы поверхность стала слегка грубой.

Затем, чтобы обеспечить эффективный перенос температуры, заполните все зазоры между алюминиевыми блоками в пробирных пластинах водой, подаваемой из пульверизатора. Теперь поместите пробные пластины на алюминиевые блоки и убедитесь, что границы находятся на расстоянии 2 сантиметров от любого края, чтобы точно совпадать с краями алюминиевых блоков.

Далее распылите пленку воды на поверхность пластин, чтобы гели не высохли. Далее накройте систему картонной коробкой, чтобы уменьшить испарение и помочь стабилизировать температуру поверхности геля. Подождите от 5 до 10 минут, чтобы температура стабилизировалась. Затем проверьте температуру поверхности пластины не менее чем в 12 местах, чтобы убедиться, что везде равномерная температура, плюс-минус 2 градуса Цельсия. Затем установите на место крышку коробки до тех пор, пока не будет проведен анализ.

Сначала снимите картонную коробку над гелем и быстро проверьте температуру поверхности геля. Если поверхность сухая, распылите на нее небольшое количество воды. Если гель хороший, то загрузите от 100 до 200 личинок в центр каждой пластины с помощью небольшой кисти. Затем накройте каждую пробирную пластину крышкой, чтобы поймать личинок, и накройте установку картонной коробкой, чтобы предотвратить попадание света. В настоящее время проводится анализ.

Через 10–30 минут снимите картонную коробку и крышку микропланшета. Затем сфотографируйте пластины сверху, чтобы зафиксировать положение личинок. Поместите коробку над камерой, чтобы избежать отражения на поверхности геля. Чтобы навести порядок в тарелке, отсасывайте всех личинок туда, где они могли разлететься.

Теперь рассчитайте процентное распределение личинок в каждой зоне с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Проведите линии через каждые 2 сантиметра исходя из разграничений на пробной пластине и подсчитайте количество личинок в каждой зоне.

- При подсчете игнорируйте личинок, распределенных по регионам в 0,5 сантиметра от каждого края. Толщина геля и температурные условия неравномерны вблизи края.