JoVE Encyclopedia of Experiments
Биология
0 просмотров • 3:01 мин • April 30th, 2023
- У мух дрозофилии надвигающийся визуальный стимул, сигнализирующий о приближении хищника, активирует нейронные цепи, которые вызывают реакцию бегства. Чтобы манипулировать нейронной цепью, которая контролирует такую реакцию, экспрессируйте трансгенный светочувствительный опсин, такой как каналродопсин-2, в определенных нейронах в этой цепи.
Каналродопсин представляет собой светочувствительный катионный канал, который открывается при воздействии яркого синего света. Последующий приток ионов натрия усиливает потенциал действия, который заставляет нейрон активироваться и передавать информацию по цепи. В дополнение к световому стимулу, кофактор all-trans-retinal необходим для открытия каналродопсина.
Поэтому обеспечьте полностью транс-ретиналь в корме для мух, так как он обычно присутствует в очень малых количествах. Кроме того, при исследовании роли нейронов в нейронной цепи, участвующей в реакции на визуальный стимул, используйте слепых мух, чтобы предотвратить другие световые реакции.
Наконец, используйте синий светодиодный свет, чтобы вызвать то же поведение, которое вызвано надвигающимся стимулом. В примере протокола мы увидим приготовление пищи и индуцированную светом поведенческую реакцию мух, экспрессирующих каналродопсин в нейронах зрительной доли.
- Начните с растопления стандартного корма из кукурузной муки в микроволновой печи и дайте ему остыть до теплого состояния. После охлаждения смешайте 50 микролитров ранее приготовленного 20-миллимолярного транс-ретинала в каждый флакон. Затем дайте флаконам остыть и храните в защищенном от света месте до тех пор, пока это не потребуется.
Во-первых, кратковременно обезболите мух на льду. Затем поместите отдельных мушек в наконечники пипеток P1000 так, чтобы кончик был срезан так, чтобы диаметр пор составлял около 2,25 миллиметра, и заклейте каждый конец лентой. Как только муха проснулась и начнет исследовать наконечник пипетки, снимите ленту и быстро поместите наконечник в углубление в вертикальном держателе. Закрепите чип на месте с помощью винта с накатанной головкой, который закрывает нижнюю часть наконечника.
Мухи обычно исследуют кончик в течение 30-60 секунд. Когда муха приблизится к верхней части кончика, начните съемку на камеру непосредственно перед тем, как муха появится на платформе. После того, как муха вылетела на платформу, подождите одну-две секунды, а затем включите синие светодиоды. Используйте таймер, чтобы вручную измерить время, пока муха не начнет полет.