Почему выделение средней кишки важно для валидации мишени?

Изоляция средней кишки позволяет напрямую изучать поведение кишечных стволовых клеток, что имеет решающее значение для валидации мишеней, участвующих в гомеостазе и регенерации кишечника. Это способствует снижению механистических рисков за счет предоставления релевантной с точки зрения заболевания системы для оценки влияния мишени на поддержание тканей.

Каким образом диссекция способствует изоляции независимых переменных в конвейерах научных открытий?

Протокол диссекции позволяет удалить мешающие ткани, такие как передняя кишка, задняя кишка и мальпигиевы сосуды, что дает исследователям возможность изолировать среднюю кишку как независимую переменную для анализа. Это гарантирует, что наблюдаемые фенотипы обусловлены специфическими процессами в средней кишке, а не системными эффектами.

Какие количественные измерения позволяет проводить FACS после диссоциации средней кишки?

Метод FACS позволяет количественно оценить частоту встречаемости, жизнеспособность и экспрессию маркеров кишечных стволовых клеток после диссоциации изолированной средней кишки. Эти измерения позволяют проводить сравнительный анализ между различными экспериментальными условиями, например, между молодыми и старыми мухами.

Почему требования к репликации важны для кросс-функционального взаимодействия?

Повторение протокола препарирования обеспечивает стабильное качество и выход материала средней кишки, что крайне важно для надежного обмена данными между группами первичного поиска, скрининга и доклинических исследований. Стандартизация воспроизведения снижает вариабельность и повышает уверенность при принятии межфункциональных решений.

Какие возможности статистического анализа необходимы перед внедрением данного метода?

Для реализации метода требуются статистические инструменты для сравнения показателей, полученных из средней кишки (таких как количество стволовых клеток или степень экспрессии маркеров), в различных условиях, что позволяет оценить значимость различий. Для принятия решений о целесообразности дальнейшего исследования (go/no-go) на основе фенотипов изолированной средней кишки достаточно базовой сравнительной статистики.

Вскрытие средней кишки у взрослой мухи: метод выделения пищеварительного тракта

JoVE Encyclopedia of Experiments

Биология

0 просмотров • 3:06 мин • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Для начала удалите голову у взрослой мухи, находящейся под наркозом. Накройте обезглавленную муху раствором, содержащим фосфатно-солевой буфер (PBS) и бычий сывороточный альбумин (BSA), чтобы избежать высыхания. Держите муху за грудную клетку щипцами, а затем подтяните брюшную полость второй парой щипцов, чтобы обнажить кишечник. Поскольку урожай или мешок для хранения продуктов будет прикреплен к грудной клетке, осторожно оттяните кишечник от грудной клетки.

После отделения потяните урожай от брюшной полости, чтобы развернуть кишечник. Оттяните задний конец мухи, чтобы начать освобождать кишку от брюшной полости. Продолжайте тянуть кишечник, чтобы вытянуть всю ткань из брюшной полости. После освобождения удалите переднюю кишку, мальпигиевые канальцы, заднюю кишку и яичники, чтобы оставить только рассеченную среднюю кишку, основное место пищеварения у мухи.

В примере протокола мы будем препарировать средние кишки у молодых и старых взрослых мух для дальнейшего анализа с помощью сортировки флуоресцентно-активируемых клеток или FACS.

- Перед началом вскрытия обезболите один флакон из 40 мух углекислым газом на стандартной подстилке для мух. Затем с помощью лезвия бритвы обезглавьте всех мух и перенесите их в тарелку для вскрытия, покрытую агарозным гелем. Налейте в блюдо достаточно холодного PBS плюс BSA, чтобы покрыть агарозу. Мухи будут плавать.

Затем для каждого насекомого по очереди захватите брюшко мухи одной парой щипцов, а грудную клетку – другой. Отделите грудную клетку от брюшной полости. Кишка будет видна, а урожай, скорее всего, все-таки будет связан с грудной клеткой. Возьмите кишку и вытащите ее из грудной клетки. Затем возьмите урожай и слегка оттяните кишку вперед от живота, чтобы развернуть его.

Далее с помощью одного из щипцов захватите задний конец живота, а другим – за край передней открытой кутикулы. Оттяните задний конец, чтобы сломать кутикулу, и продолжайте тянуть сзади очень осторожно, пока вся кишка не будет вытянута из брюшной полости. Удалите переднюю кишку, мальпигиевые трубы, заднюю кишку и яичники, оставив оголенную среднюю кишку.

По мере того, как средние кишки изолированы, используйте стеклянную пипетку Пастера для периодического переноса нескольких тканей кишечника за раз в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку, содержащую холодный PBS плюс BSA на льду.