Подготовка сердца дрозофилы: методика изучения физиологии сердца у взрослой мухи

- В отличие от позвоночных, сердце дрозофилы является частью открытой кровеносной системы. Сердце взрослой мухи представляет собой трубчатую структуру, построенную из кардиомиоцитов, которая соединена с эпидермисом алярными мышцами и встроена во внеклеточный матрикс. Камера сердца находится на заднем конце мухи и нагнетает гемолимфу в аорту, из которой она впадает в открытую полость тела.

У насекомых гемолимфа служит как кровью, так и интерстициальной жидкостью, перенося питательные вещества, сигнальные молекулы и иммунные клетки. К дополнительным ориентирам сердца относятся остии, которые представляют собой отверстия вдоль трубки, и внутрисердечные клапаны. Клетки перикарда локализуются вдоль сердечной трубки и являются частью выделительной системы мухи.

В экспериментальном препарате сердца искусственная гемолимфа имитирует физиологические условия для сохранения функции тканей. Хотя естественная гемолимфа не отвечает за газообмен, искусственная гемолимфа должна быть хорошо насыщена кислородом, чтобы восполнить отсутствие функциональной трахейной системы. В следующем эксперименте мы демонстрируем полуинтактный сердечный препарат взрослой мухи для визуализации в реальном времени или электрофизиологии.

- Прежде чем приступить к работе, мы сначала готовим искусственный раствор гемолимфы. Этот раствор содержит сахарозу и трегалозу, которые следует добавлять в искусственную гемолимфу из охлажденных исходных растворов непосредственно перед использованием с целью предотвращения бактериального загрязнения. Доведите искусственную гемолимфу до комнатной температуры и насытьте раствор кислородом путем барботирования воздуха в течение не менее 15 минут.

Далее вытяните несколько тонких капилляров с помощью стандартного съемника пипетки, который понадобится для удаления жировых тел у мухи.

После того, как все будет подготовлено, взрослых мух необходимо обезболить. Это можно сделать с помощью кратковременного пребывания во время дневного сна от двух до пяти минут, но будьте осторожны, чтобы не оставлять мух в спете от мух дольше пяти минут. Кратковременное воздействие холода также может быть использовано для обезболивания мух, но углекислый газ не рекомендуется, поскольку он оказывает более длительное воздействие на частоту сердечных сокращений и ритмичность.

Далее обезболенных мух помещают спинной стороной вниз в чашку Петри, покрытую тонким слоем вазелина. Гидрофобная кутикула в крыльях и на теле должна обратимо прилипать к желе, но при необходимости муху можно переместить. Первоначальный разрез делается с помощью изогнутых пружинных ножниц. Это делается путем помещения лезвий ножниц под ноги мухи и под углом вниз к тыльной поверхности грудной клетки возле шеи.

Голова, вентральный нервный канатик и ноги удаляются с помощью одного надреза. После разрезания препарат погружают в насыщенный кислородом раствор искусственной гемолимфы. С помощью пружинных ножниц задний кончик живота, который состоит из брюшного сегмента 7 и 8, удаляется одним разрезом. Это обеспечивает доступ для выполнения боковых разрезов по обоим краям живота и служит для разрыва связи между задней кишкой и кутикулой живота.

Вставьте лезвия ножниц в небольшое отверстие на кончике живота и разрежьте кутикулу сбоку. При этом освобождается один край вентральной кутикулы. Обхватите лоскут щипцами и сделайте аналогичный разрез по противоположному боковому краю живота. Теперь можно удалить освобожденный лоскут вентральной кутикулы живота.

Кишечник и другие органы брюшной полости обычно могут быть удалены как единое образование с помощью ювелирных щипцов и легких перетягиваний. При удалении внутренних органов обнаруживается бьющаяся сердечная трубка, которая все еще прикреплена к тыльной кутикуле небольшими алярными мышцами и окружена жировыми телами. Вытянутые капилляры вставляются в пластиковую трубку размером 1/16 дюйма, прикрепленную к источнику вакуума. Сила всасывания пропорциональна диаметру наконечника, поэтому не следует использовать пипетки с наконечниками диаметром более 40 микрон.

После настройки эта аспираторная система используется для отсасывания лишнего жира вокруг сердечной трубки. Его также можно использовать для удаления пузырьков воздуха, которые скапливаются вокруг кутикулы и любого мусора. Необходимо проявлять крайнюю осторожность, чтобы не прикасаться к самому сердцу, а поскольку задняя часть сердца очень хрупкая, следует вообще избегать этой области. Сердечная трубка взрослой дрозофилы теперь обнажена и должна биться.

При необходимости кутикулу и прикрепленное сердце можно переместить, аккуратно приподняв кутикулу из вазелина и осторожно утрамбовав ее обратно, опять же избегая любого контакта с сердечной тканью. На этом этапе раствор для купания препарата следует заменить на свежий, искусственный гемолимфа. Перед любыми манипуляциями этому препарату следует дать сбалансироваться в течение 20-30 минут с оксигенацией. Если препарат должен сохраняться дольше 60 минут, его следует повторно перфузировать свежей искусственной гемолимфой. В настоящее время этот препарат готов к использованию для оптической регистрации, а также может быть использован для электрофизиологической регистрации или для гистологических манипуляций.