Энциклопедия экспериментов JoVE
Биология
0 просмотров • 2:56 мин. • April 30th, 2023
- Начните с подготовки соединения, которое будет проверено на токсичность, и распределите его по лункам пробирной пластины. Перенесите червей соответствующей стадии развития в каждую скважину, и сразу запустите таймер. Обратите внимание на всех поврежденных червей и не включайте их в расчеты выживания.
По прошествии заранее определенного времени подсчитайте количество червей, которые еще живы в каждой скважине. Яркий свет диссекционного микроскопа или легкое постукивание по пластине должны заставить живых червей сдвинуться с места. Повторяйте это наблюдение через каждый промежуток времени, пока большинство животных не умрет. В следующем протоколе мы будем наблюдать за временем выживания личинок L4 при воздействии параквата, соединения, которое вызывает окислительный стресс.
- В этой демонстрации окислительный стресс будет индуцирован с помощью параквата. Приготовьте свежий 100 миллимолярный раствор параквата, как описано в сопроводительном тексте протокола. Паракват является опасным и высокотоксичным соединением, и с ним необходимо обращаться в соответствии с соответствующими рекомендациями.
Пипеткой подайте 40 микролитров раствора параквата в каждую лунку 96-луночного планшета. Используйте не менее 12 скважин в качестве реплик каждого тестируемого состояния. Используя кирку для червей из платиновой проволоки, перенесите от пяти до восьми личинок L4 в каждую скважину.
Укажите время начала и время окончания для каждого тестируемого состояния. Установите 96-луночный планшет при температуре 20 градусов Цельсия. Через час после старта оцените мертвых и живых животных с помощью препарирующего микроскопа. Аккуратно встряхните тарелку перед началом счета.
Черви, которые не двигаются даже после обнаружения света высокой интенсивности, считаются мертвыми. Обратите внимание на форму червя, хвосты и движение головы при большом увеличении, чтобы отличить мертвых червей от живых. Оценивайте выживаемость каждый час, пока большинство червей не умрут, и повторяйте этот анализ по крайней мере три независимых раза.
Чтобы определить процент выживаемости для каждой временной точки, сначала рассчитайте общее количество животных в одном состоянии, сложив общее количество животных, переведенных в каждую скважину. Не обращайте внимания на животных, которые были повреждены или убиты при транспортировке. Затем для каждой временной точки вычислите общее количество мертвых животных в одном условии. Рассчитайте процент смертности и процент выживаемости.