С. elegans Анализ хемотаксиса: метод проверки хемоощущения у червей

- Чтобы понять возникающие условия и соответствующим образом реагировать на них, червь C. elegans имеет, среди прочего, высокоразвитую хемосенсорную систему, способную обнаруживать широкий спектр различных химических веществ.

Сенсорные нейроны в голове, амфидные и внутренние лабиальные нейроны, а также нейроны в хвосте, фазмидные нейроны, прямо или косвенно подвергаются воздействию внешних условий через кутикулу. Эти хемосенсорные нейроны кодируют релевантную информацию, используемую червем для создания соответствующей поведенческой реакции: поведения, называемого хемотаксисом.

Чтобы проверить хемотаксическую реакцию на летучие запахи или вкусовые водорастворимые сигналы, изолируйте червей желаемой стадии развития и подвергните их воздействию испытуемого химического вещества на заранее подготовленной экспериментальной арене. При воздействии благоприятных химических веществ, подобных тем, которые вырабатываются бактериальным источником пищи, C. elegans проявляет положительный хемотаксис по отношению к источнику.

И наоборот, при воздействии менее благоприятных или токсичных химических веществ, таких как тяжелые металлы, червь проявляет отрицательный хемотаксис, избегая химического вещества. Следовательно, обонятельные или вкусовые мутанты не могут избежать аверсивных химических веществ и остаются в неблагоприятных условиях, в отличие от диких животных, которые избегают аверсивного состояния.

В примере протокола мы увидим демонстрацию анализа хемотаксиса, проверяющего отвращение червя к меди.

- После ночной инкубации извлеките пластины из инкубатора и, используя отмеченную нижнюю сторону пластины в качестве ориентира, нанесите пипеткой 100 микролитров свежеприготовленного 0,5 молярного раствора двух сульфатов меди на край агара для создания наружного медного барьера. Пипеткой внесите 25 микролитров раствора двух сульфатов меди для создания срединного барьера.

Убедитесь, что раствор меди и двух сульфатов не контактирует с бактериальным пятном, и дайте раствору меди высохнуть на пластине. Проверяйте сухость каждые пять минут после переноса лабораторной салфеткой, слегка промокнув раствор у края планшета, чтобы сделать его заметным.

Непосредственно перед анализом перенесите экспериментальные организмы в агаровую пластину, свободную от бактерий, и дайте нематодам свободно перемещаться в течение одной минуты, чтобы удалить избыток бактерий.

Далее пипеткой нанесите 1 миллилитр М9 на планшет с молодыми взрослыми особями, которые были перенесены за 24 часа до этого, чтобы смыть червей в микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте нематод в 3000 раз больше g в течение одной минуты.

Черви должны образовать гранулу на дне трубки. Аспирация раствора М9 без разрушения гранул червяка. Добавьте в гранулу червя 1 миллилитр раствора М9. Переверните трубку, чтобы смешать червей с раствором.

Если избыток бактерий изначально передался с червями, повторите в общей сложности пять раз. После окончательной промывки аспирируйте надосадочную жидкость до 100 микролитров раствора М9 и останется гранула червя. Немедленно перелейте червей из раствора после завершения этапов промывки.

Нанесите пипеткой 20 микролитров гранулы червя со дна пробирки на свободную от бактерий половину пластины для анализа. Убедитесь, что 10 червей перенесены на пробирную пластину и что в ней нет загрязняющей пищи. Никакие бактерии не должны переноситься на медные пищевые тарелки.

Излишки раствора М9 удалить из нематод с помощью лабораторной ткани в течение одной минуты. Убедитесь, что раствор M9 не контактирует с раствором медного и двух сульфатов, а черви и поверхность агара остаются неповрежденными. Откажитесь от глистов, которые были случайно удалены вместе с лабораторной тканью.

После того, как раствор М9 был удален и у всех червей начались нежидкие локомоторные паттерны, т.е. когда они перестали биться, запустите секундомер анализа. Если в тарелку случайно попали лишние черви, удалите их, обработав галоидоуглеродным маслом, чтобы убедиться, что на тарелку не добавлены бактерии.

Проверяйте пробирные пластины каждые 30 минут. Для тестовых планшетов с бактериальными пятнами положительная оценка микроорганизмов, если они достигли пищевого пятна в течение четырехчасового периода. Для отрицательных контрольных пластин положительная оценка организмов, если они пересекли барьер.