С. elegans Отслеживание движений: метод оценки локомоции у червей

- Чтобы оценить локомоцию C. elegans, используйте камеру, чтобы зафиксировать движение червей на агаровой пластине, обеспечивая равномерное освещение пластины во время записи. Чтобы ограничить движение червей по пластине, используйте медные кольца. Медь вызывает отвращение у C. elegans, поэтому черви загоняются в кольца.

Поместите несколько медных колец на одну пластину, чтобы одновременно отслеживать червячки в каждом кольце. Это позволяет проводить оценку контрольных и экспериментальных животных в идентичных условиях, снижая повседневную изменчивость и позволяя проводить параллельные сравнения. Записывайте движение червей в течение заданных интервалов времени и используйте компьютерное программное обеспечение для анализа особенностей поведения локомотива, таких как скорость движения и пройденное расстояние.

В примере протокола мы увидим демонстрацию анализа отслеживания движения, проверяющего влияние алкоголя на скорость передвижения червя.

- Для начала потратьте две минуты или меньше, чтобы перенести 10 червей из каждой экспериментальной группы в центр медного кольца на акклиматизационной пластине. Это тарелка без этанола. Избегайте переноса пищи вместе с червями, так как это уменьшит их движение. Также не повреждайте поверхность агара, потому что черви будут закапываться. Запишите время загрузки на пластину и обязательно распределите перенос червей на каждую пластину более чем на две минуты, чтобы каждую пластину можно было снимать отдельно с соответствующим интервалом времени.

Дайте каждой акклиматизационной пластине поинкубироваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем перенесите червей на пробирную пластину, следуя порядку, в котором черви размещались на акклиматизационной пластине. Используя плоский червячный кирка с тонкими краями без бактерий, соберите червей поверх сплющенной кирки с помощью черпающего движения. Затем запечатайте пластину лабораторной пленкой, чтобы свести к минимуму потери этанола при испарении.

- Скорость, с которой животные переводятся на этом этапе, очень важна, потому что переведенные животные будут дольше подвергаться воздействию этанола. Таким образом, хорошей идеей является чередование деформаций, размещенных на пластине в первую очередь на экспериментальных репликах.

- В настоящее время для съемки червей необходим микроскоп с видеокамерой высокого разрешения. Равномерное освещение, например, от трехдюймовой квадратной подсветки, имеет жизненно важное значение для анализа. Затем, чтобы сохранить контрастность, изобразите пластину стороной вверх.

Подготовьте программное обеспечение для анализа изображений для захвата 120-кадровых, 12-битных, оттенков серого, цейтраферных видеороликов за один кадр в секунду. Чтобы уменьшить размер выходного файла, сохраняя при этом достаточное разрешение изображения, используйте режим группирования «два на два».

Теперь запишите двухминутные фильмы с каждой пластины, через 10 минут после того, как на эту пластину были помещены последние черви. Затем сделайте вторую двухминутную запись, через 30 минут после того, как черви были помещены на тарелку. Для этой демонстрации используется программное обеспечение Image-Pro Plus, так как широкий спектр других программ может быть адаптирован к этой технике. Анализируйте фильмы в виде двухминутных сегментов.

Сначала примените фильтр к изображениям, который сгладит фон и повысит контрастность объектов-червей. В меню выберите «Обработка», затем «Фильтры», затем «Улучшение», а затем «Сведение». Установите параметр для темного фона и ширины функции 20 пикселей.

Теперь проанализируйте передвижение животных в каждом кольце отдельно с круговой областью интереса, которая перекрывает медное кольцо. Идентификация и отслеживание червей с помощью команды «Отслеживать объекты» в подменю «Измерить».

В окне Таблица данных трекинга используйте кнопку Параметры трекинга, чтобы исключить определенные треки и ограничить любые экспериментальные артефакты. На вкладке Автослежение установите для параметров трека ограничение скорости 400 микрон на кадр. Установите для параметра Предел ускорения значение Автоматически.

Установите Минимальную общую длину трассы на 400 микрон, а для параметра Преобладающий тип движения установите значение Хаотичный. Затем в параметре Track (Track Parameter) задайте объекты таким образом, чтобы минимальная длина частичных дорожек составляла 21 кадр, а глубина проекции трекинга (Tracking Projection Depth) равнялась одному кадру.

Теперь, чтобы начать процесс отслеживания, сначала нажмите функциональную кнопку «Найти все треки автоматически». Откроется диалоговое окно «Параметры количества/размера» и диалоговое окно «Отслеживание». Выберите параметр «Вручную» для параметра «Выбор диапазона интенсивности» в диалоговом окне «Количество/размер». Это обеспечивает важный пороговый шаг. Затем настройте ползунки «Порог интенсивности», чтобы создать инклюзивный диапазон, в котором темные объекты будут выделены. Хорошей отправной точкой на шкале является диапазон от 0 до 1 500.

Теперь примените фильтр по размеру, чтобы исключить объекты, которые больше или меньше одного червя. Перейдите в меню Измерение, а затем выберите подменю Измерение. Откроется диалоговое окно Параметры количества/размера. Там установите диапазон площади от 28 000 до 120 000 квадратных микрон. И установите диапазон периметра от 600 до 2 500 микрон. Вносите коррективы в эти параметры при использовании червей аномальных размеров.

Теперь завершите процесс отслеживания, нажав кнопку «Продолжить» в диалоговом окне отслеживания. Дважды проверьте, что вывод совпадает с отснятым материалом фильма. Убедитесь, что представлен каждый червь, если нет явной причины для его фильтрации. Затем вручную удалите дорожки, созданные объектами, не являющимися червями.

Затем вычислите скорость каждого червя, усреднив расстояние, пройденное между каждым кадром или каждой секундой, и создайте среднюю скорость для следов в каждой популяции. Рассматриваем это итоговое среднее значение как одну из опорных точек для статистического анализа эксперимента.