Визуализация кальция: метод визуализации нейронной активности у живых C. elegans

- Поместите одного трансгенного червя, экспрессирующего GCaMP - кальциево-чувствительный белок, - в камеру визуализации вместе с бактериальной пищей для червя. Затем запечатайте посуду крышкой и лабораторной пленкой, чтобы предотвратить испарение. Рассмотрите его под сложным микроскопом, оснащенным для широкоугольной эпифлуоресценции. Записывайте покадровые изображения червей, чтобы отслеживать их поведение и захватывать флуоресценцию с помощью программного обеспечения для визуализации.

Трансгенные черви экспрессируют сенсорный белок GCaMP под контролем промотора, который управляет экспрессией GCaMP в определенном нейроне. Когда этот нейрон активируется, он запускает потенциал действия, который деполяризует плазматическую мембрану. При деполяризации в плазматической мембране открываются потенциал-зависимые кальциевые каналы. Это вызывает приток ионов кальция в клетку, что приводит к возбуждению нейронов.

GCaMP в возбужденном нейроне связывает ионы кальция. Это приводит к флуоресциации GCaMP при визуализации червей с помощью флуоресцентного возбуждающего света низкой интенсивности. В примере протокола мы будем использовать визуализацию кальция для визуализации активности интернейронов AVA в трансгенных C. elegans в агарозных микрокамерах.

- Визуализация кальция выполняется на сложном микроскопе, оснащенном для широкопольной эпифлуоресценции. Чтобы ограничить воздействие света, используйте транзисторно-транзисторный логический сигнал, который запускает светодиод для освещения образца в то время, когда камера записывает кадр.

Запустите серийный видеоролик в течение 24 часов, в котором каждый червь будет отображаться каждые 15–30 минут. Сначала запишите 20 секунд с помощью DIC, затем 20 секунд с помощью флуоресценции GFP и, наконец, изображение сигнала mKate2 для контроля уровней экспрессии.

Для визуального контроля данных используйте карту ложных цветов, чтобы улучшить видимость небольших изменений интенсивности флуоресценции. Наконец, проведите анализ данных о кальции с помощью стандартных процедур.