Энциклопедия экспериментов JoVE
Биология
0 просмотров • 3:21 мин. • April 30th, 2023
- Для начала переложите молодых взрослых червей на свежую агарозную подушечку на горке. Затем добавьте несколько капель 12 миллимолярного раствора левамизола, чтобы парализовать глистов. Накройте червей покровным стеклом и подождите несколько минут. Поместите предметное стекло под вращающийся дисковый конфокальный микроскоп и сфокусируйтесь на боковой наружной поверхности червя.
Эпидермис взрослого червя представляет собой тонкую однослойную структуру, состоящую из многоядерных синцитий, которые образуются в результате слияния клеток. Апикальная поверхность эпидермиса выделяет гибкую коллагеновую кутикулу, в то время как базальная поверхность покрыта тонким слоем внеклеточного матрикса, называемым базальной пластинкой.
Далее лазером наматывают апикальную поверхность эпидермиса. Цитоплазма из поврежденных клеток может вытекать наружу, проявляясь в виде пузыря в месте раны.
Лазерное облучение имеет преимущество перед другими методами, такими как игольное ранение, так как вызывает локализованное нарушение кутикулы и клеток эпидермиса, не повреждая внутренние ткани. В примере протокола мы увидим процесс лазерного ранения у C. elegans.
- Для точного намотки нематод в этом протоколе используется фемтосекундный лазер, прикрепленный к конфокальным микроскопу с вращающимся диском. Линейного или точечного сканирования с использованием фемтосекундных лазеров, таких как в двухфотонных микроскопах, также должно быть достаточно.
- Начните с того, что соберите 10 молодых людей на агаровой подушке. Парализуйте их в двух микролитрах капли 12 миллимолярного раствора левамизола. Затем накройте их чехлом и подождите несколько минут, пока они парализуются.
- Важно, чтобы животное было полностью парализовано. 12 миллимолярный левамизол не повлияет на реакцию раны. Однако можно использовать и другие методы иммобилизации.
- Убедитесь, что мощность фемтосекундного лазера установлена на 140 милливатт, измеренная перед объективом, а частота повторения лазера составляет 80 мегагерц. Теперь найдите червей под вращающимся диском конфокального микроскопа. Используя 100-кратный объектив с высокой числовой апертурой, сфокусируйтесь на латеральном переднем или заднем синцитиальном эпидермисе целевого червя.
Фокусируясь на апикальной поверхности эпидермальной клетки, лазер получает свет на два импульса по 200 миллисекунд, разделенных 20 миллисекундами. Этого должно быть достаточно, чтобы ранить эпидермис. Подождите немного и понаблюдайте за локальным нарушением цитоплазмы, которое будет проявляться в виде пузырей. При наличии флуоресцентного маркера может наблюдаться локализованное обесцвечивание.