Кормление FITC-декстраном: метод количественной оценки проницаемости кишечника у C. elegans

- C. elegans используется в качестве экспериментальной модели инфекции кишечными патогенами, вызывающими заболевание, в частности, нарушая кишечный барьер, повышая его проницаемость. Чтобы количественно оценить целостность барьера после воздействия интересующих бактерий или химических соединений, соберите червей, смыв их с пластин.

Затем поместите этих червей на агаровые тарелки с маркированной пищей, состоящей из убитой при нагревании кишечной палочки, смешанной с ФИТК-декстраном, высокомолекулярным полисахаридом с флуоресцентной меткой.

Позвольте червям поедать помеченные бактерии. У червей с неповрежденным кишечным барьером пища быстро выводится из организма, в то время как у червей с более проницаемым кишечником флуоресцентный маркер проникает за пределы просвета органа.

Переведите глистов в раствор формальдегида, чтобы закрепить животных. Через 1-2 минуты замените формальдегид монтажным материалом.

Наконец, визуализируйте червей с помощью флуоресцентной микроскопии. Обратите внимание, что кишечные гранулы C. elegans являются автофлуоресцентными, поэтому будет присутствовать фоновый сигнал. Но в целом, большая флюоресценция кишечника указывает на более высокую проницаемость.

В примере протокола мы проверим влияние обработки биомолекулой DIM на проницаемость кишечника червей, инфицированных патогенными бактериями Pseudomonas aeruginosa.

- Приготовьте планшеты с добавкой FITC-декстрана, смешав 2 миллилитра инактивированной при нагревании кишечной палочки с 4 миллиграммами FITC-декстрана. Добавьте по 100 микролитров смеси в каждую из 20 свежих пластин с агаром NGM и дайте пластинам высохнуть в течение часа на чистом лабораторном столе. Через 48 часов обработки промойте гельминтов S Buffer. Переложите их в планшеты с добавками FITC-декстрана и в планшеты NGM без FITC-декстрана и инкубируйте планшеты в течение ночи.

На следующий день промойте червей с помощью S Buffer и дайте им поползти в свежей агаровой пластине NGM в течение часа. Добавьте 50 микролитров 4% формальдегида в каждую лунку черной 96-луночной пластины с плоским дном и перенесите примерно 50 червей в каждую лунку. Через 1-2 минуты удалите весь формальдегид и добавьте по 100 микролитров монтажной среды в каждую лунку.

- Формальдегид является токсичным химическим веществом, и с ним следует обращаться осторожно.