Микроинъекция гонад: метод доставки соединения непосредственно в зародышевую линию C. elegans

- Чтобы подготовиться к инъекции, с помощью червячной кирки уложите дорожку галоидоуглеродного масла на агарозную подушечку. Поместите червей в масло и обездвижьте их, аккуратно надавливая на агаровую подушку. Убедитесь, что масло полностью покрывает животных. Он позволяет кислороду поступать к червям, предотвращая высыхание. Затем поместите агарозную подушечку на инъекционный микроскоп и расположите иглу перпендикулярно червю, нацеливаясь на дистальный конец плеча гонады.

Аккуратно протолкните иглу через кутикулу и введите в плечо гонады интересующую вас нуклеиновую кислоту или соединение. Каждое плечо гонады содержит синцитий зародышевой линии, который будет развиваться в отдельные ооциты. Материал, введенный в дистальную гонаду, будет включен в эти ооциты и повлияет на следующее поколение.

После введения червей замените масло на буфер M9. Как только черви начнут двигаться, переложите их на тарелку с агаром NGM с бактериальной пищей. В следующем протоколе метод микроинъекции гонад используется для доставки комплекса Cas9 к мишени и редактированию гена dpy-10.

- Начните с приготовления подушечек C. elegans и агарозы, как описано в текстовом протоколе. Поместите агарозную инъекционную подушечку и крышку на эндоскоп для вскрытия. С помощью червячной кирки проложите небольшую дорожку галоидоуглеродного масла вдоль одного края подушечки. Затем с помощью червячной кирки, покрытой маслом, поднимите несколько червей с пластины NG агара в масляную дорожку. С помощью тонкого волоска, прикрепленного к пипетке, например, ресницы или кошачьего уса, расположите червей параллельно, осторожно проталкивая червей в агарозную подушечку. До тех пор, пока вы не освоитесь с процедурой микроинъекции, садитесь и вводите только одного червя за раз.

Когда черви будут на месте и прикреплены к подушечке, нанесите на червей еще несколько капель галоидоуглеродного масла с кончика червячной кирки. Поместите крышку с установленными червячками на инъекционный микроскоп. При малом увеличении расположите червей перпендикулярно игле для инъекций, которая была заполнена раствором РНП, как описано в текстовом протоколе.

Переключитесь на большое увеличение и переместите иглу рядом с плечом гонады, соответствующей области рядом с ядрами в средне- и позднем пахитене. С помощью микроманипулятора переместите иглу против червя, слегка надавливая на кутикулу. Затем одной рукой постучите по боковой стороне предметного стекла микроскопа, чтобы встряхнуть иглу через кутикулу. Нажмите педаль или кнопку инъекции, медленно заполните гонадный рычаг смесью для инъекций и извлеките иглу. Повторите этот шаг с другим плечом гонад.

После того, как черви будут введены, снимите покровную крышку с агарозной прокладки и поместите ее под препарирующий микроскоп. С помощью вытянутой капиллярной пипетки вытесните масло из червей, наложив на них пипетирование буфера M9. Выполняйте эту обработку, чтобы освободить глистов от агара. Через 10 минут, когда черви начнут метаться в буфере, переместите их на назогастральный агаровый планшет с бактериями OP50 с помощью вытянутой капиллярной пипетки. Поместите пластину при температуре 20 градусов Цельсия на два-три часа, пока черви не восстановятся и не начнут двигаться. После восстановления по отдельности перенесите червей в планшеты с назогастральным агаром с OP50 Затем переложите пластины в инкубатор с температурой 25 градусов Цельсия.