Применение низкочастотного ультразвука: метод определения влияния ультразвуковой обработки на клетки лейкемии человека

- Для начала посейте клетки лейкемии человека в свежеприготовленную питательную среду и инкубируйте в течение желаемого периода. После инкубации окрасьте небольшое количество этой клеточной суспензии трипановым синим и оцените жизнеспособность клеток с помощью предметного стекла счетчика клеток TC20. Мертвые клетки проницаемы и поглощают отрицательно заряженный краситель, в то время как жизнеспособные клетки непроницаемы.

Затем добавьте метилбета-циклодекстрин в культуральную колбу, чтобы в достаточной степени истощить уровень холестерина в клетках, делая их восприимчивыми к ультразвуку. Инкубируйте клетки в течение нужного срока. Заполните систему ультразвуковой обработки клеток деионизированной водой и дегазируйте ее в течение нескольких минут, чтобы избежать образования вакуумных пузырьков. Перенесите нужное количество клеток в сцинтилляционный флакон и прикрепите флакон к удерживающему устройству системы ультразвуковой обработки клеток.

Поместите удерживающее устройство на верхнюю часть звукового сигнала и установите желаемую высоту от верхней части звукового сигнала. Установите необходимые импульсы на нужную длительность для ультразвуковой обработки клеток. Добавьте трипановый синий в клеточную суспензию и поместите ее в счетчик клеток TC20 для анализа жизнеспособности и повреждения клеток. Клетки лейкоза, обработанные метилбета-циклодекстрином, при воздействии низкочастотного ультразвука демонстрируют значительный лизис клеток.

В следующем протоколе мы изучим ультразвуковую обработку клеток и оценку повреждений клеток лейкемии человека.

- Чтобы подготовить клетки к ультразвуковой обработке, сначала засейте их в соотношении от 4 до 10 до 4 клеток на миллилитр в колбу площадью 25 квадратных сантиметров, используя свежеприготовленную среду. После определения количества жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего инкубируют культуру при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе до тех пор, пока культура не достигнет желаемой концентрации. Когда ячейки будут готовы к ультразвуковой обработке, используйте вакуум и колбу Бюхнера для дегазации объема ионизированной дистиллированной воды. Затем с помощью воды наполните горн чаши на расстояние до 15 миллиметров над верхней частью рога.

Запустите систему с дегазированной водой в течение примерно семи минут, затем перелейте 3 миллилитра клеток в стеклянный 20-миллилитровый сцинтилляционный флакон и прикрепите флакон к удерживающему устройству. Затем прикрепите удерживающее устройство к верхней части горна чашки и с помощью скользящего механизма установите удерживающее устройство на высоту 15 миллиметров от верхней части горна у поверхности воды. Теперь произведите ультразвуковую обработку клеток с помощью трех односекундных ультразвуковых импульсов с интервалом в одну секунду между каждым из импульсов с амплитудой от 33% до 50%.

Оценивайте жизнеспособность клеток после ультразвуковой обработки методом исключения трипанового синего. Чтобы оценить повреждение клеток, промывайте отверстие анализатора частиц Z2 не менее 2 раз изотоническим физиологическим раствором. Затем добавьте 100 микролитров обработанных ультразвуком клеток в 20 миллилитров изотонического раствора и переложите образец клеток в держатель счетчика. Затем поднимите платформу к отверстию и проанализируйте повреждения клеток, жизнеспособность и мусор в соответствии с инструкциями производителя.