Анализ XTT: колориметрический анализ для оценки жизнеспособности клеток и митохондриальной активности

- Низкочастотные ультразвуковые волны приводят к избирательному лизису клеток лейкемии человека, а анализ XTT помогает определить степень этого повреждения. Анализ основан на принципе, согласно которому митохондриальные ферменты здоровых клеток преобразуют желтый краситель XTT в оранжевое соединение под названием формазан. Чтобы начать анализ, обработайте клетки метилбета-циклодекстрином, разрушающим холестерин агентом, а затем обработайте клетки ультразвуком при низкой мощности, чтобы вызвать повреждение клеток.

Центрифуга для гранулирования клеток и добавления свежей питательной среды для клеток в гранулу. Засейте клетки в нужной концентрации в многолуночную микропластину и инкубируйте ее в течение ночи. Теперь добавьте активированный раствор XTT в клетки и инкубируйте до тех пор, пока в лунках микропланшета не разовьется оранжевый цвет. Поместите пластину в спектрофотометр. Измерьте поглощение на 450–500 нанометрах, а затем на 630–690 нанометрах. Вычтите эти два значения, чтобы получить точные результаты. Более высокое значение абсорбции в анализе XTT указывает на более высокую активность митохондриальных ферментов и более высокую жизнеспособность клеток.

В следующем видео мы продемонстрируем использование анализа XTT для определения эффективности низкочастотных ультразвуковых волн для причинения повреждения клеток лейкемии, обработанных метилбета-циклодекстрином.

- Чтобы оценить жизнеспособность обработанных ультразвуком клеток с помощью анализа XTT, озвучивайте клетки с помощью диапазона от одного до трех односекундных импульсов, основанных на интервале в одну секунду, чтобы разработать диапазон повреждений для оценки с помощью набора XTT. Затем раскрутите ячейки вниз и повторно суспендируйте гранулы до 1 ум 10 на пятую клетку на миллилитр в свежеприготовленной питательной среде. Затем засейте 100 микролитров клеток на лунку в отдельные 96-луночные микротитровальные планшеты с плоским дном в трех экземплярах, включая три контрольные лунки, содержащие 100 микролитров только полной питательной среды для чистых показаний поглощения. Инкубируйте клетки в течение 24 часов.

Утром в день проведения анализа осторожно взбейте аликвоты XTT, нагретые при температуре 37 градусов Цельсия, и активирующие реагенты до тех пор, пока растворы не станут прозрачными. Затем добавьте 0,1 миллилитра активационного реагента в 5 миллилитров аликвоты реактива XTT. Затем добавьте по 50 микролитров активированного раствора XTT в каждую лунку инокулированных планшетов U937 и THP1 и верните клетки в инкубатор для клеточных культур. Через два часа осторожно встряхните пластины, чтобы равномерно распределить оранжевый краситель в положительных лунках, и измерьте абсорбцию на считывателе микротитров в диапазоне от 450 до 500 нанометров. Наконец, снова измерьте поглощение всех пробирных лунок в диапазоне от 630 до 690 нанометров.