2D кокультура лейкозных клеток с BMSC: метод получения субпопуляций лейкозных клеток

- В системе 2D-совместного культивирования несколько типов клеток выращиваются вместе в плоских культуральных планшетах. Эта система культивирования облегчает изучение клеточных взаимодействий и поведения in vitro. Чтобы создать кокультуру лейкозных клеток со стромальными клетками костного мозга, или BMSC, добавьте суспензию лейкозных клеток к адгезивной монослойной культуре BMSCs. Инкубируйте планшет в соответствующих условиях культивирования. Поддерживайте сокультуру, заменяя 90% питательной среды каждый четвертый день.

Во время этой 2D-кокультуры лейкозные клетки взаимодействуют с BMSC и локализуются в различных областях культуры, образуя три субпопуляции. Фазово-контрастная микроскопия позволяет визуально дифференцировать три субпопуляции. Первая группа лейкозных клеток, которые кажутся свободно плавающими в среде, относятся к категории взвешенных клеток. Вторая группа лейкозных клеток, которые прилипли к поверхности монослоя BMSC, выглядит яркой и классифицируется как фазово-светлые клетки.

Третья группа лейкозных клеток, которые мигрировали под монослой, выглядит тусклой и классифицируется как клетки с затемненной фазой. В соответствии с приведенным ниже протоколом мы выполняем совместное культивирование острого лимфобластного лейкоза, или клеток ОЛЛ, со стромальными клетками костного мозга человека.

- Начните с посева от 5 до 20 раз с 10 до шестой лейкемических клеток в 10 мл опухолеспецифичной питательной среды на 100-миллиметровую пластину, содержащую от 80% до 90% сливающихся стромальных клеток костного мозга или остеобластов. Каждый четвертый день наклоняйте пластину в сторону и отсасывайте все, кроме 1 миллилитра среды, стараясь не нарушить адгезивный клеточный слой. Затем осторожно добавьте 9 миллилитров свежей среды для культуры лейкемических клеток, капните в угол пластины вдоль боковой стороны, чтобы обеспечить минимальное нарушение адгезивных клеток.

После 12-го дня совместного культивирования осторожно пипетируйте питательную среду вверх и вниз по планшету примерно от 5 до 10 раз, чтобы собрать плавающие лейкозные клетки, и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем повторно засейте клетки на новую пластину, содержащую от 80% до 90% сливающихся стромальных клеток костного мозга или остеобластов, как показано выше. К 4-му дню будут сформированы три субпопуляции лейкозных клеток: взвешенные лейкозные клетки свободно плавают в среде, светлые по фазе лейкозные клетки прилипают к поверхности монослоя адгезивных клеток, а лейкозные клетки с тусклой фазой мигрируют под монослой.