Сбор лейкозных субпопуляций: метод пространственного разделения субпопуляций лейкемических клеток из 2D кокультуры

- Когда лейкозные клетки культивируются совместно с мезенхимальными стромальными клетками, они взаимодействуют со стромальными клетками и образуют три субпопуляции. Свободно плавающие взвешенные клетки, светлые по фазе клетки, прилипшие к поверхности мезенхимального монослоя, и тусклые по фазе клетки под мезенхимальным монослоем. Чтобы разделить каждую субпопуляцию, берут планшет для культивирования тканей с монослоем мезенхимальных стромальных клеток.

Посейте лейкозные клетки, присутствующие в опухолеспецифичных питательных средах, на монослой и инкубируйте планшет в течение желаемого времени. Далее соберите опухолевые клетки в суспензию путем пипетирования свободно плавающих клеток в отдельную пробирку. Теперь добавьте свежую среду в планшет и энергично пипеткуйте, чтобы вытеснить яркие в фазе опухолевые клетки с поверхности мезенхимального монослоя.

Соберите эти клетки, пипетируя их в отдельной пробирке. Добавьте трипсин в пластину для удаления адгезивных мезенхимальных клеток. Добавьте фетальную бычью сыворотку, или FBS, чтобы остановить действие трипсина и разрушить клеточные агрегаты. Теперь соберите ячейки с затемненной фазой в пробирку. Центрифугируйте все три пробирки, содержащие различные субпопуляции клеток, по отдельности и повторно суспендируйте гранулу в свежей среде для дальнейшего анализа. В следующем протоколе мы изолируем суспензионные, фазовые и тусклые лейкозные клетки из 2D-кокультуры.

- Чтобы собрать субпопуляцию взвешенной опухоли, аспирируйте среду из планшета для совместной культуры лейкозных клеток и используйте ту же среду для осторожной промывки планшета один раз. Затем перенесите субпопуляцию лейкозных клеток с плавающей суспензией в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Чтобы собрать субпопуляцию опухоли с фазовым светом, добавьте 10 миллилитров свежей среды обратно в планшет для совместного культивирования

и промывайте примерно пять раз достаточно энергично, чтобы удалить адгезивные лейкозные клетки, не смещая монослой адгезивных клеток. Затем перенесите фазовую яркую субпопуляцию в ее собственную коническую трубку объемом 15 миллилитров. Чтобы собрать субпопуляцию опухоли с затемненной фазой, удалите оставшуюся среду с помощью промывки PBS объемом в один миллилитр и отделите клетки тремя миллилитрами трипсина при температуре 37 градусов Цельсия.

Через пять минут осторожно постучите по стенкам пластины, чтобы выбить адгезивные клетки, с последующим добавлением одного миллилитра FBS для остановки ферментативной реакции. Затем промойте сыворотку от трех до пяти раз, чтобы разрушить любые крупные клеточные агрегаты и перенести неочищенную субпопуляцию в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Когда все субпопуляции будут собраны, раскрутите клетки и снова суспендируйте каждую из гранул в одном миллилитре предварительно подогретой среды.