Ретроорбитальный забор крови: метод выделения мононуклеарных клеток из ретроорбитального синуса мыши

- Во-первых, возьмите мышь под наркозом за шею и выпячьте глаз. Вставьте тонкую капиллярную трубку в медиальный кантус глаза. Дайте крови течь капиллярным действием в пробирку. Перелейте кровь в пробирку, покрытую покрытием ЭДТА, и держите ее на льду. ЭДТА связывает ионы кальция, препятствуя свертыванию крови. Более низкая температура снижает гликолитическую активность клеток и вероятность микробного загрязнения.

Далее разбавьте кровь буфером, содержащим ЭДТА, и хорошо перемешайте. Аккуратно добавьте на дно слой соответствующего разделительного раствора, не тревожа кровь. Центрифугируйте суспензию. Полимер в разделительном растворе агрегирует эритроциты и осадок на дне. Мононуклеарные элементы и тромбоциты, будучи легче полимера, откладываются выше полимерного градиента.

Удалите верхний слой, содержащий плазму, и соберите непрозрачное белое кольцо, содержащее мононуклеарные клетки. Разбавьте клетки с помощью PBS и центрифуги для удаления остаточной плазмы и тромбоцитов. Используйте выделенные мононуклеарные клетки для дальнейшего анализа. Следующий протокол продемонстрирует выделение мононуклеарных клеток из конгенной мыши, которой была введена лейкемическая клеточная линия C1498.

- Вставьте капиллярную трубку в медиальный кантус глаза животного, находящегося под наркозом. От 100 до 200 микролитров крови будет взято из орбитального синуса в капиллярную трубку. Извлеките трубку и остановите кровотечение, аккуратно наложив стерильную марлевую губку на глаз. Затем переложите кровь в пробирку с ЭДТА и храните пробирку на льду до тех пор, пока мононуклеарные клетки не будут изолированы.

Чтобы изолировать мононуклеарные клетки крови, сначала добавляют PBS с добавлением 1 миллимолярного ЭДТА до конечного объема 500 микролитров. Затем перенесите образец в микроцентрифужную пробирку. Затем с помощью шприца объемом 1 миллитр, оснащенного иглой 30-го калибра, осторожно нанесите 500 микролитров разделительного раствора под кровь, стараясь не перемешать слои.

Разделите клетки центрифугированием и с помощью пипетки перенесите непрозрачный слой белых мононуклеаров в новую микроцентрифужную пробирку. Затем промойте иммунные клетки в 1 миллилитре PBS. Центрифугируйте их и повторно суспендируйте гранулу в 600 микролитрах буфера FACS для окрашивания и анализа методом проточной цитометрии.