$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- У пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом, или ХЛЛ, значительно увеличивается количество В-клеточных лимфоцитов в костном мозге и крови. Чтобы выделить эти клетки ХЛЛ из образца крови, сначала обработайте образец коктейлем для обогащения В-клеток человека, который разделяет В-клетки с помощью отрицательного отбора. Антитела в коктейле специфически распознают и сшивают антигены, экспрессируемые не-В-клетками и эритроцитами, образуя плотные комплексы.
Затем образец наносят на среду с градиентом плотности, имеющую плотность, оптимальную для выделения лимфоцитов. При последующем центрифугировании различные компоненты крови разделяются в зависимости от вариаций их плотности относительно градиентной среды. Комплексы эритроцитов-не-В-клеток с более высокой плотностью оседают через среду, образуя гранулы. Наименее плотная плазменная фракция образует самый верхний слой. Менее плотные клетки ХЛЛ образуют белый слой на границе плазмы и плотной среды.
Аккуратно переложите белый слой в свежую трубочку. Снова центрифугируйте для получения гранулы, содержащей очищенные клетки ХЛЛ. В следующем протоколе мы показываем выделение клеток хронического лимфоцитарного лейкоза из образцов крови пациента.
- Получение образцов периферической крови у пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом в пробирках для сбора крови ЭДТА с подсчетом лейкоцитов.
- Образцы крови человека следует расценивать как опасные, так как они потенциально содержат вирусы, передающиеся через кровь. Пожалуйста, убедитесь, что эти образцы обрабатываются в шкафу биобезопасности класса II и что пользователь всегда одет в лабораторный халат и перчатки. Утилизируйте материалы, зараженные кровью, и продезинфицируйте их.
- Если количество лейкоцитов равно или превышает 40 миллионов клеток на миллилитр, разбавьте образец в соотношении 1 к 1 с помощью промывочного буфера RT CLL. Затем поместите градиент плотности RT в коническую центрифужную пробирку соответствующего размера для образца. Тщательно выложите образец поверх среды и центрифугируйте при 400-кратном G в течение 30 минут при RT.
С помощью пластиковой пастеровской пипетки аккуратно соберите белый слой мононуклеарных ячеек, собранных на границе градиентной плотности среды и промывочного буфера ХЛЛ. Переложите этот изолированный монослой в свежую коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Для промывки ячеек добавьте в этот монослой 40 миллилитров промывочного буфера ХЛЛ и центрифугируйте при 300-кратном G в течение 10 минут при комнатной температуре.
Выбросьте надосадочную жидкость, поверните дно тюбика, чтобы снова суспендировать гранулу, и повторите эту промывку. Выбросьте надосадочную жидкость, снова щелкните дном трубки, а затем снова суспендируйте клеточную гранулу в установленном объеме буфера для промывки ХЛЛ, в зависимости от размера гранулы. После подсчета клеток и после проточной цитометрии для проверки чистоты клеток поместите клетки в планшеты для культуры тканей с необходимой плотностью клеток, готовые к стимуляции или медикаментозному лечению.