Получение субклеточных фракций из лейкозных клеток: метод получения клеточных и ядерных фракций из лейкозных клеток

- В лейкозных клетках нарушается регулирование макромолекул, таких как несколько белков, подавляющих опухоль, между ядром и цитоплазмой. Неправильная локализация этих белков делает их неактивными, что приводит к неконтролируемому росту лейкозных клеток. Мы можем определить аберрантное расположение таких белков, генерируя цитоплазматическую и ядерную фракцию из лейкозных клеток.

Начните с того, что возьмите желаемый объем лейкозных клеток в микрофугическую пробирку и центрифугируйте для гранулирования клетки. Повторно суспендируйте гранулу в буфере для гипотонического лизиса, а затем добавьте желаемую концентрацию моющего средства. Гипотонический буфер для лизиса заставляет клетки набухать и разрывать плазматическую мембрану, оставляя ядерную мембрану нетронутой, тем самым выделяя цитоплазматические фракции. Моющее средство помогает в извлечении белков из цитоплазматических органелл.

Центрифугируйте лизированные клетки в суспензии и перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку. Надосадочная жидкость содержит цитоплазматическую фракцию клетки. Чтобы приготовить ядерную фракцию, оставшуюся гранулу суспендируют в буфере полного лизиса и добавьте моющее средство. Центрифугируйте и соберите ядерную фракцию, присутствующую в надосадочной жидкости, в микрофугальную пробирку. Храните цитоплазматическую и ядерную фракции при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа. В следующем протоколе мы продемонстрируем генерацию субклеточных фракций из лейкозных клеток.

После завершения инкубации стимуляции и/или медикаментозного лечения происходит перенос клеток в индивидуально помеченные 1,5-миллилитровые микрофуговые пробирки и гранулы путем центрифугирования при 200-кратном перегрузке в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 миллилитре ледяного PBS с ингибиторами фосфатазы. Центрифугируйте при 200 умноженных на g в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и держите эти гранулы цельного клеточного экстракта на льду для дальнейшей подготовки.

Для приготовления цитоплазматических фракций следует аккуратно ресуспендировать клеточные гранулы в 50 микролитрах 1 Х гипотонического буфера. Чтобы дать клеткам набухнуть, инкубируйте их на льду в течение 15 минут. После выполнения градиента моющего средства для определения оптимальной концентрации детергента для использования для конкретного типа клеток, добавьте от 0,8 до 2,5 микролитров моющего средства в каждый образец и переведите его на самую высокую настройку в течение 10 секунд.

Чтобы проверить лизис клеток, наблюдайте за клетками под фазово-контрастным микроскопом до и после добавления моющего средства. Все клетки имеют плотное темное ядро, окруженное цитоплазмой, которая проявляется в виде яркого ореола. После лизиса центрифугируйте образцы при 14 000 умноженных на g в течение 30 секунд при температуре 4 градуса Цельсия. Осторожно, не потревожив гранулу, переложите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную, меченую микрофуговую пробирку и храните эту цитоплазматическую фракцию при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего анализа.

Обеспечить полное удаление цитоплазматической фракции для предотвращения загрязнения ядерной фракции.

К оставшейся грануле, в которой содержится ядерная фракция, добавьте 50 микролитров буфера полного лизиса и повторно суспендируйте пипетированием вверх и вниз. Чтобы солюбилизовать белки, связанные с ядерной мембраной, добавьте 2,5 микролитра моющего средства, смешайте на самую высокую настройку в течение 10 секунд и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Ввергните на самую высокую настройку в течение 30 секунд и центрифугируйте. Затем переложите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную, помеченную микрофужную пробирку и храните эту ядерную фракцию при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего анализа.