Анализ внеклеточного потока: метод измерения метаболического профиля клеток

- Анализ внеклеточного потока помогает изучать клеточный метаболизм путем измерения двух основных энергетических путей — гликолиза и митохондриального дыхания. Во время гликолиза клетки метаболизируют глюкозу и выделяют лактат во внеклеточное пространство вместе с протонами, что определяется путем измерения скорости внеклеточного подкисления или ECAR. Во время митохондриального дыхания клетки используют кислород для производства АТФ, что измеряется путем определения скорости потребления кислорода или OCR.

Раковые клетки демонстрируют высокое поглощение глюкозы, поскольку они изменяют скорость метаболизма, чтобы адаптироваться и поддерживать нерегулируемую клеточную пролиферацию. Чтобы проанализировать метаболизм в раковых клетках, сначала соберите микропланшет для анализа потока, содержащий адгезивный монослой раковых клеток и гидратированный сенсорный картридж. Перенесите пластину в сборе в анализатор флюса. Внутри анализатора зонды датчика опускаются вниз, создавая переходную микрокамеру. Для измерения внеклеточного потока инъекционный порт вводит тестовые соединения в микропланшет в заданные моменты времени.

В зависимости от клеточного метаболизма колеблются концентрации доступного кислорода и высвобождаемых протонов в микрокамере. Два флуорофора, встроенные в основание картриджа, одновременно измеряют уровни кислорода и протонов, свидетельствующие о митохондриальном дыхании и гликолизе соответственно. В следующем протоколе мы продемонстрируем анализ внеклеточного потока для измерения метаболической активности первичных лейкозных клеток.

- Тем временем, чтобы подготовить планшеты для анализа внеклеточного потока, добавьте по 12,5 микролитров клеточного адгезивного раствора в каждую лунку двух 8-луночных планшетов для анализатора внеклеточного потока. Через 20 минут аспирируйте клеточный клей и промойте каждую лунку два раза 200 микролитрами стерильной воды на одну промывку.

После второй промывки оставьте пластины в колпаке до тех пор, пока лунки не высохнут, а сенсорный картридж положите вверх дном на лабораторный стол. Отделите рабочую пластину и сенсорный картридж анализатора потоков и заполните каждую лунку технологической пластины 200 микролитрами калибра и каждый ров вокруг внешней стороны лунок 400 микролитрами калибра.

Верните картридж датчика на рабочую пластину, в которой теперь находится калибр, и поместите блок картриджа во увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия без CO2 на ночь. Затем включите анализатор внеклеточного потока и дайте ему нагреться до 37 градусов Цельсия на ночь.

На следующее утро переложите клетки из колбы в конические пробирки объемом 50 миллилитров для центрифугирования, а гранулы снова суспендируйте в 1 миллилитре соответствующей экспериментальной среды для подсчета. Ресуспендировать клетки в 4 раза по 10-6 ячеек в 400 мкл концентрации опытной среды и добавить 50 мкл клеток в лунки В-G планшета анализатора потока и по 180 мкл экспериментальной среды в лунки А и Н в качестве фоновых контрольных лунок.

После центрифугирования медленно и осторожно добавьте 130 микролитров экспериментальной среды в лунки от B до G и визуально подтвердите стабильное прилегание клеток к дну каждой лунки под микроскопом. Затем верните планшет для анализа флюса во увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия без CO2 на 30 минут.

За 20 минут до окончания инкубации загрузите составы в соответствующие инжекторные порты картриджа согласно протоколу эксперимента, указанному в таблице. Затем настройте соответствующую программу анализа внеклеточного потока. Запустите программу и замените пластину калибра на пластину для анализа, когда будет предложено.