Обогащение Т-клеток: метод выделения Т-клеток из смешанной популяции клеток с помощью магнитной сепарации

- Т-клетки, класс лимфоцитов, играют активную роль в борьбе с инфекцией. Наряду со многими другими типами клеток крови, иммунокомпетентные Т-клетки присутствуют в селезенке и лимфатических узлах мыши. Чтобы избирательно изолировать Т-клетки, собирайте мышиную селезенку и лимфатические узлы и мацерируйте их на клеточном фильтре. Промойте ткань соответствующей средой для получения одноклеточной суспензии.

Добавьте хлорид аммония и калий, или буфер ACK, чтобы лизировать эритроциты. Центрифуга для отделения неповрежденных клеток крови от лизата. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в подходящем буфере. Обработайте суспензию смесью биотинилированных антител к мышам для нацеливания на клетки крови, такие как гранулоциты, В-клетки, NK-клетки и любые оставшиеся эритроциты. Т-клетки не являются мишенью и, следовательно, остаются непомеченными.

Далее добавьте в суспензию антибиотин магнитные микрошарики. Все меченые биотином клетки связываются с микрогранулами. Под воздействием сильного магнитного поля магнитно меченые клетки прилипают к стенке трубки. Немеченые Т-клетки остаются во взвешенном состоянии. Соберите несвязанные обогащенные Т-клетки в свежую пробирку для сбора. В следующем протоколе мы показываем выделение Т-клеток из селезенки и лимфатических узлов мыши с использованием метода магнитной сепарации.

- Объедините лимфатические узлы и селезенку в фильтр для пор размером 40 микрометров и с помощью поршня шприца мацерируйте ткани через фильтры, чтобы освободить клетки. Промойте сетчатый фильтр и поршень средой RPMI с добавлением 1% FBS, чтобы собрать все клетки и осадить клетки путем центрифугирования. Добавьте в клеточную гранулу 5 миллилитров буфера для лизиса ACK.

Через пять минут при комнатной температуре остановите реакцию с 5 миллилитрами среды с добавлением 1% FBS и гранулируйте лейкоциты центрифугированием. Ресуспендируйте гранулу в 5 миллилитрах буфера MACS для подсчета и разведите клетки до концентрации от 2 до 10 до 8 клеток на микролитр в свежем буфере MACS. Добавьте соответствующую концентрацию антиэритроидных, антигранулоцитарных, анти-В-клеточных и анти-NK-клеток истощенных антител из расчета 1 умножить на 10 к 6 клеткам для 15-минутной инкубации при 4 градусах Цельсия.

В конце инкубации промойте клетки 10 миллиметрами ледяного буфера MACS и повторно суспендируйте гранулу в концентрации от 1 до 10 до 8 клеток на миллилитр в свежем буфере MACS. Далее добавьте 0,22 микролитра микрогранул антибиотина из расчета 1 умножить на 10 в 6 клеток с перемешиванием в течение 15-минутной инкубации при 4 градусах Цельсия.

В конце инкубации промойте клетки 10 миллилитрами ледяного буфера MACS и соберите несвязанные обогащенные Т-клетки путем разделения магнитных шариков с помощью экспресс-сепаратора MACS в соответствии со стандартными протоколами выделения шариков. В конце разделения осадите Т-клетки методом центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах свежего буфера MACS для подсчета.