Why is LPS activation critical for dendritic cell maturation in this protocol?

LPS binds to surface receptors on dendritic cells, triggering full maturation and immunogenicity, which is essential for assessing their ability to activate T cells in downstream applications.

How does GM-CSF concentration influence dendritic cell differentiation from bone marrow progenitors?

The addition of 20 nanograms per milliliter of GM-CSF drives the differentiation of bone marrow-derived progenitor cells into dendritic cells over a six-day culture period, as specified in the protocol.

What quantitative measurements indicate successful dendritic cell generation and maturation?

Successful generation is indicated by adherent non-phagocytic cell morphology, while maturation is confirmed by upregulated expression of co-stimulatory molecules such as CD80 and CD86 following LPS activation.

Why is erythrocyte lysis with ACK buffer a necessary step before dendritic cell culture?

ACK buffer lyses contaminating red blood cells isolated from bone marrow, preventing interference with dendritic cell differentiation and ensuring a purified progenitor cell population for culture.

What statistical analysis is recommended to compare dendritic cell maturation across experimental conditions?

Flow cytometry-based quantification of maturation markers like CD86 mean fluorescence intensity enables statistical comparison using t-tests or ANOVA to assess significant differences between treatment groups.

Генерация дендритных клеток из костного мозга: метод получения дендритных клеток из костного мозга мыши

JoVE Encyclopedia of Experiments

Исследования рака

0 просмотров • 2:57 мин • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Дендритные клетки или ДК являются ключевыми антигенпрезентирующими клетками, которые активируют Т-клетки. У пациентов с лейкемией эти клетки плохо экспрессируют опухолеассоциированный антиген и не могут вызвать антиген-специфический иммунный ответ. Дендритные клетки в изобилии присутствуют в костном мозге. И, следовательно, костный мозг является предпочтительным местом для их выделения, чтобы помочь изучить их роль в развитии рака.

Чтобы получить дендритные клетки, извлеките костный мозг из бедренной или большеберцовой кости усыпленной мыши с помощью шприца, наполненного средой, чтобы вымыть его. Центрифугируйте и ресуспендируйте гранулу в аммоний-хлоридно-калийный буфер или буфер ACK для лизиса эритроцитов. Теперь добавьте питательную среду для остановки лизиса и центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в питательной среде, содержащей антибиотик. Добавьте гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор или GM-CSF и перенесите клеточную суспензию на пластину Петри.

Инкубируйте пластину в течение желаемого времени. GM-CSF помогает клеткам-предшественникам дифференцироваться в дендритные клетки. Наконец, активируйте клетки липополисахаридами или ЛПС, которые связываются с поверхностным рецептором дендритных клеток, в результате чего образуются полностью зрелые и иммуногенные дендритные клетки костного мозга. В этом протоколе мы продемонстрируем генерацию дендритных клеток из костного мозга мыши.

- Для получения дендритных клеток, полученных из костного мозга, выделите костный мозг из бедренных костей дикого типа или мышей с нокаутом фактора В, как показано, и лизируйте эритроциты в 5 миллилитрах буфера для лизиса ACK, остановив реакцию 10 миллилитрами RPMI, дополненными 1% FBS через пять минут.

После сбора цельных клеток крови методом центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитров питательной среды в концентрации от 2 до 10 до 6 клеток на миллилитр и добавьте 20 нанограммов на миллилитр GM-CSF в клетки, прежде чем засеять 10 миллилитров клеток на отдельные чашки Петри размером 100 на 15 миллиметров при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение шести дней. На шестой день активируйте культуры дендритных клеток, полученные из костного мозга, с помощью 25 микрограммов на миллилитр ЛПС на пластину.