Иммунопреципитация хроматина: методика изучения белок-ДНК-взаимодействий в клетках

- Хроматиновая иммунопреципитация, или ChIP, — это метод, используемый для определения белково-ДНК-взаимодействий в клетках. Белки связываются с определенными участками ДНК и регулируют экспрессию генов. Во-первых, стабилизируют комплекс ДНК-белок с помощью формальдегида. Формальдегид сшивает белки с соответствующей последовательностью ДНК, образуя ковалентные связи.

Затем используйте подходящий буфер для лизиса для лизиса клеток с целью высвобождения хроматина, содержащего сшитые ДНК-белковые комплексы. Центрифугировать суспензию и ультразвуком обрабатывать надосадочную жидкость для получения фрагментов хроматина. Впоследствии пометьте образец подходящим антителом, которое специфически связывается с ДНК-связанным белком.

Добавьте в образец специализированные магнитные шарики. Шарик распознает антитело и связывается с ним. С помощью магнита соберите магнитные шарики с комплексом антитело-белок-ДНК. Промойте образец, чтобы удалить несвязанный хроматин или антитела. Добавьте в комплекс буфер с высокой концентрацией соли и инкубируйте при более высоких температурах, чтобы обратить вспять поперечные связи белков ДНК.

С помощью магнита соберите надосадочную жидкость, содержащую ДНК и белки. Добавьте фермент протеиназу К, чтобы разрушить белки в образце. Добавьте подходящий буфер для осаждения ДНК и используйте его для дальнейшего анализа. В следующем протоколе будет продемонстрирована иммунопреципитация хроматина в клетках хронического лимфоцитарного лейкоза для идентификации генов-мишеней NFAT2.

- Сначала приготовьте 20 микролитров покрытых белком А шариков для каждого осадка в одной 1,5-миллилитровой тубе. Дайте шарикам осесть на магнитной решетке в течение одной минуты и удалите надосадочную жидкость. Затем промойте шарики 40 микролитрами 1x ChIP буфера, 1 на каждые 20 микролитров покрытых белком А шариков, пипетируя вверх и вниз.

Дайте шарикам осесть на магнитной решетке в течение одной минуты и удалите надосадочную жидкость. Повторите этот процесс промывки еще три раза, прежде чем суспендировать шарики в их первоначальном объеме 1x буфер ChIP 1. Добавьте в бусины BSA, ингибитор протеазы, 5x буфер ChIP и воду класса ChIP-seq. Далее добавляем срезанный хроматин.

Используйте 10 микрограммов антител против NFAT2 для захвата NFAT2 и 2,5 микрограмма антител IgG в качестве контроля. Инкубируйте смеси в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия на колесе, вращающемся со скоростью шесть оборотов в минуту. На следующий день вращайте трубки в течение пяти секунд с температурой 7000 раз больше g и инкубируйте их на магнитной решетке в течение одной минуты.

Затем аспирируйте надосадочную жидкость и промойте шарики один раз с помощью буферов для промывки 1, 2, 3 и 4 подряд. Вращайте пробирки в течение пяти секунд со скоростью 7 000 g перед инкубацией пробирок на магнитной стойке в течение одной минуты. После этого снимите надосадочную жидкость и добавьте следующий буфер для стирки.

После последней промывки вращайте пробирки в течение пяти секунд со скоростью 7 000 g. Инкубируйте пробирки на магнитной решетке в течение одной минуты. Удалите надосадочную жидкость и наберите шарики в 100 микролитрах элюирующего буфера 1. Затем инкубируйте трубки на вращающемся колесе в течение 30 минут.

Далее кратковременно закрутите трубки и поместите их на магнитную решетку на одну минуту. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 4 микролитра элюирующего буфера 2. Для создания входного регулятора смешайте 1 микролитр сдвигового хроматина с 99 микролитрами элюирующего буфера один и 4 микролитрами элюирующего буфера два. Затем инкубируйте образцы в течение четырех часов при температуре 65 градусов Цельсия с встряхиванием.

После этого добавьте в пробирки 100 микролитров 100% изопропанола. Сделайте вихрь и вращайте образцы в течение пяти секунд при 7000 раз больше. Затем добавьте в каждый образец по 10 микролитров магнитных шариков. Сделайте вихрь и инкубируйте образцы на вращающемся колесе при комнатной температуре в течение часа.

Затем кратковременно закрутите трубки и поместите их на магнитную решетку на одну минуту. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте шарики в 100 микролитрах промывочного буфера. Переверните трубки, перемешайте и инкубируйте их в течение пяти минут на вращающемся колесе при комнатной температуре. Далее кратковременно центрифугируйте пробирки. Поместите их в магнитный штатив на одну минуту и с помощью пипетки удалите надосадочную жидкость.

Затем добавьте 100 микролитров промывочного буфера два. Переверните трубки, чтобы перемешать, и инкубируйте их в течение пяти минут на вращающемся колесе при комнатной температуре. После этого кратковременно центрифугируйте пробирки и поместите их в магнитный штатив на одну минуту. Снимите буфер для промывки на два раза с помощью аспирации и снова суспендируйте шарики в 55 микролитрах буфера для элюирования.

Чтобы вымыть осажденную ДНК, инкубируйте образцы во вращающемся колесе при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого коротко покрутите трубки и поместите их в магнитную решетку на одну минуту. Наконец, переложите надосадочную жидкость в новые 1,5 миллилитровые трубки.