Культивирование и заготовка клонов HSPC: способ получения односортированных клонов HSPC

- Гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки или ГСКК, могут самообновляться и дифференцироваться в различные типы клеток крови. ГСКК постепенно накапливают мутации ДНК в течение жизни, которые могут способствовать развитию лейкемии. Для анализа таких мутаций ГСКК обычно генерируются из костного мозга.

Начните с добавления флуорофор-конъюгированных антител к мононуклеарным клеткам — взрослым стволовым клеткам, выделенным из костного мозга — и инкубируйте их в течение желаемого времени. Антитела связываются со специфическими маркерами клеточной поверхности, такими как CD34. Теперь загрузите смесь в флуоресцентно-активируемую клеточную цитометрию или аппарат FACS.

Флуорофор-конъюгированные антитела флуоресцируют при попадании лазера. Отдельные капли клеток проходят через детектор, который измеряет интенсивность флуоресценции, на основе чего капля обладает электрическим зарядом. В присутствии электромагнитных полей положительно заряженные элементы перемещаются в отрицательный контейнер и наоборот.

Теперь выращивайте CD34-положительные ГСК, отсортированные FACS, в подходящей среде в течение желаемого периода времени, пока клоны не станут видимыми. Затем вытесните клоны с помощью энергичного пипетирования и центрифуги для гранулирования клеток. Храните гранулы, содержащие клональные ГСКФ, при температуре минус 20 градусов Цельсия для дальнейшего анализа. В следующем протоколе мы создадим клоны HSPC из мононуклеарных ячеек.

- Начните эту процедуру с подготовки материала образца и окрашивания, как описано в текстовом протоколе. Затем приготовьте 25 миллилитров питательной среды для гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, или HSPC. Заполните 384-луночный планшет для культивирования клеток 75 микролитрами питательной среды HSPC в каждой лунке. Чтобы предотвратить испарение среды во внешних лунках, заполните внешние лунки 75 микролитрами стерильной воды или PBS и не используйте эти лунки для сортировки клеток.

Правильная сортировка жизнеспособных сигнальных HSPC является наиболее важным этапом в этом протоколе. Установите затворы для сортировки HSPC на основе неокрашенного контроля в 10 000 клеток из образца окрашивания. Затвор одиночных ячеек путем рисования строба вокруг линейной высоты прямого рассеяния в зависимости от доли площади прямого рассеяния.

Используйте неокрашенную контрольную дробь, чтобы нарисовать ворота для фракции родословной. Нарисуйте вентили для CD34-положительных клеток и дополнительно охарактеризуйте это подмножество, установив специфический вентиль для CD38-отрицательных, CD45RA отрицательных клеток. Загрузите 384-луночный планшет на машину FACS и отсортируйте отдельные ячейки. Если это применимо к компьютеру FACS, включите опцию сохранения данных сортировки индексов, чтобы включить повторную трассировку отсортированных ячеек.

Для культивирования одиночно отсортированных ГСК оберните 384-луночный планшет с крышкой в прозрачную полиэтиленовую пленку. Перенесите планшет на 384 лунки в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа и подержите его в инкубаторе в течение трех-четырех недель, пока не появятся видимые клоны. После четырех недель культивирования определите, какие лунки имеют сливаемость 30% или выше.

Для каждого клона предварительно заполните 1,5-миллиметровые микропробирки 1 миллилитром 1% BSA в PBS и пометьте пробирку в соответствии с соответствующей лункой. Предварительно смочите наконечник пипетки 1% BSA в PBS, чтобы свести к минимуму количество клеток, прилипших к наконечнику пипетки. Яростно пипетируйте среду вверх и вниз не менее пяти раз, соскребая дно лунки с помощью пипетки объемом 200 микролитров объемом 75 микролитров.

Соберите клеточную суспензию в помеченную микропробирку, которая соответствует лунке. Повторите пипетирование в лунке с содержанием до 75 микролитров свежих 1% BSA и PBS, чтобы обеспечить максимальное поглощение клетками. Клонально культивируемые клетки могут прилипать к дну лунки. Осмотрите лунки с помощью стандартного микроскопа с инвертированным светом, чтобы убедиться, что все клетки были собраны.

Если все лунки с конфлюенцией более 30% были собраны, поместите планшет на 384 лунки обратно в инкубатор. Клональные культуры могут размножаться до пяти недель. Уменьшите клеточную суспензию в течение пяти минут при 350 умноженных на g. Должна быть видна небольшая лепешка. Осторожно удалите все, кроме примерно пяти микролитров надосадочной жидкости. Клеточные гранулы можно замораживать при температуре минус 20 градусов Цельсия и хранить в течение нескольких месяцев до выделения ДНК.