Магнитно-активируемая сортировка клеток: метод выделения c-Kit положительных клеток

- c-Kit, или CD117, представляет собой трансмембранный рецептор тирозинкиназы, экспрессируемый гемопоэтическими стволовыми или прогениторными клетками, присутствующими в костном мозге и крови. Он также является маркером для выявления острого миелоидного лейкоза.

Чтобы выделить c-Kit положительные клетки, соберите кости ног мышей и раздавите их, чтобы освободить костный мозг изнутри. Отфильтруйте суспензию костного мозга, чтобы удалить любые костные фрагменты. Нанесите слой фильтрата, содержащего клетки костного мозга, на среду с градиентом плотности и центрифугируйте для отделения мононуклеарных клеток от других фракций.

Соберите мутный слой мононуклеарных клеток в пробирку, содержащую микрогранулы, конъюгированные с антителами к CD117 мыши. Инкубируйте комплексы антитела-гранулы для связывания с рецепторами CD117 на c-Kit положительных клетках. Пропустите инкубированную суспензию через магнитную колонку, помещенную в магнитное поле. Все положительные клетки c-Kit, меченные магнитными микрогранулами, остаются в колонке, в то время как немеченые клетки проходят через нее.

Извлеките колонку из магнитного поля и промойте содержимое с помощью подходящего буфера для элюирования положительных ячеек c-Kit. В следующем протоколе мы покажем выделение положительных клеток c-Kit из костного мозга трансгенной мыши.

- Для начала соберите кости ног у усыпленной мыши. Очистите ткани от костей с помощью скальпеля. Затем поместите кости в холодный PBS на лед и раздавите кости пестиком. После этого отфильтруйте клеточную суспензию через 70-микрометровый клеточный фильтр в 50-миллилитровую пробирку с винтовой крышкой с 10-миллилитровой пипеткой. Вымойте ступку и несколько раз поставьте пестиком холодный PBS, а клеточную суспензию добавьте в 50-миллилитровую трубку.

Далее центрифугируют костный мозг и удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуума и стеклянной пипетки. Ресуспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах PBS. С помощью пипетки медленно добавьте во взвешенный костный мозг до верха полисукрозы комнатной температуры.

После этого вращайте полисахарозу со скоростью 400 G в течение 20 минут с выключенным тормозом. После цетрифугации соберите с помощью пипетки мутную общую моноядерную ячейку и перенесите ее в новую 15-миллилитровую пробирку. Доведите объем до 10 миллилитров с помощью PBS и снимите 20 микролитров для подсчета.

После цетрифугации выбросьте надосадочную жидкость и положите гранулу на лед. Затем повторно суспендируйте клеточную таблетку в PBS с ЭДТА и БСА. Добавьте микрогранулы CD117 в клеточную суспензию и перемешайте. После этого выдерживают суспензию в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Затем увеличьте объем до 10 миллилитров с помощью PBS с ЭДТА и БСА и центрифугируйте при 1200 G при 4 градусах Цельсия в течение пяти минут.

Используйте вакуум для удаления надосадочной жидкости и суспензии клеточной гранулы в PBS с ЭДТА и БСА. Затем добавьте три миллилитра PBS с ЭДТА и БСА в магнитную подставку с магнитной колонкой и дайте ему стечь в сборную трубку. После того, как буфер закончит протекать через колонку, добавьте суспензию ячеек и дайте ей протечь через колонку в сборную трубку.

Далее добавьте в колонку еще 5 миллилитров PBS с ЭДТА и БСА и сразу же промойте ее поршнем. Снимите поршень и повторите промывку перед подсчетом ячеек. После центрифугирования клеток удалить надосадочную жидкость и суспензировать клеточную гранулу в полной IMDM для культивирования. Культивируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.