Ретровирусно-опосредованная трансдукция: метод введения гена-мишени в раковые клетки

- Ретровирусы — это РНК-вирусы, которые реплицируются с помощью обратной транскриптазы для преобразования своего генома РНК в двухцепочечную ДНК и постоянной интеграции в геном хозяина. Новые вирусные частицы выходят из клетки и могут заражать другие клетки. В генной терапии рака используются ретровирусные векторы для введения терапевтических генов в клетки-мишени с помощью метода, называемого трансдукцией, чтобы подавить мутировавший ген или уничтожить клетки.

Чтобы получить ретровирусные векторы с высоким титром, трансфектируйте клетки HEK 293 трансфекционной смесью, содержащей желаемую ретровирусную плазмиду, упаковочную плазмиду и подходящий трансфектирующий агент. Инкубируйте клетки. Трансфектирующий агент способствует доставке обеих плазмид в клетки.

Ретровирусная плазмида кодирует вирусный геном с геном-мишенью, в то время как упаковочная плазмида кодирует белки вирусной оболочки. Клеточный механизм упаковочных клеток формирует ретровирусные частицы и высвобождает их в среду. Соберите вирусную надосадочную жидкость и центрифугуйте для удаления клеток.

Переносите желаемую концентрацию вирусных частиц и раковых клеток на культуральную пластину, покрытую фибронектином, чтобы облегчить связывание белков вирусной оболочки с клетками. Инкубируйте клетки. Соберите клетки и проведите проточную цитометрию для анализа эффективности трансдукции. В соответствии с этим протоколом будет проводиться ретровирусно-опосредованная трансдукция c-Kit-положительных клеток костного мозга мыши.

- Сначала соедините ДНК ретровирусной плазмиды с упаковочной плазмидой, хлоридом кальция и водой в пробирке объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте 500 микролитров HBS в другую 1,5-миллилитровую трубку. Добавьте трансфекционную смесь по каплям в пробирку, содержащую HBS, одновременно перемешивая с вихревым аппаратом, установленным на самую низкую настройку.

Инкубируйте трансфекционную смесь при комнатной температуре от 20 до 30 минут. В течение инкубационного периода добавляйте хлорохин в клетки HEK и держите их в инкубаторе. После добавления трансфекционной смеси инкубируйте клетки в течение 8 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, 5% CO2, очень медленно меняя клеточную среду, добавляя 14 миллилитров свежей среды DMEM 10. Медленное пипетирование к стенке чашки помогает предотвратить любое удаление клеток HEK.

Затем инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, 5% CO2. Используйте шприц объемом 10 миллилитров для сбора вирусной надосадочной жидкости. Затем прикрепите к шприцу шприцевой фильтр 0,45 мкм. Погрузите вирусную надосадочную жидкость в новую пробирку для сбора. Соберите вирусный надосадочный слой примерно через 16 часов.

После этого добавьте 2 миллилитра рекомбинантного фрагмента человеческого фибронектина в PBS в необработанные 6-луночные культуральные планшеты. На следующий день с помощью пипетки удалите фибронектин из пластин. Залейте планшеты 2% BSA в PBS и инкубируйте планшеты при комнатной температуре в течение 30 минут.

Используйте пылесос для удаления BSA и промойте пластины PBS, прежде чем снимать их с помощью пылесоса. После этого сразу же добавьте отфильтрованную вирусную надосадочную жидкость и центрифугируйте пластину в течение двух часов. С помощью пылесоса удалите надосадочную жидкость и снова поверните пластину.

Далее удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума и промойте лунки с вирусным покрытием PBS. Снимите PBS с помощью пылесоса. Добавьте ранее культивированные клетки мыши c-Kit+ в лунки, покрытые вирусной оболочкой. После центрифугирования инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через 48 часов после трансдукции гранулируйте клетки с помощью центрифугирования и повторно суспендируйте их в буфере FACS No 1.