JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 3:31 мин • April 30th, 2023
- Иногда стволовая клетка или клетка-предшественник претерпевает мутации, в результате чего образуется лейкемическая стволовая клетка. В этих клетках определенные белки активируются, и использование противоопухолевых соединений против таких белков может помочь контролировать рост клеток. Действие этих противоопухолевых соединений можно проанализировать с помощью анализа КОЕ путем мониторинга количества и размера образовавшихся колоний.
Начните с взятия клеток-предшественников у лейкемической мыши и разбавьте их в подходящей питательной среде. Добавьте эту клеточную суспензию вместе с соответствующим противоопухолевым соединением к метилцеллюлозе, содержащей мышиные цитокины, и вылейте ее в чашку Петри. Инкубируйте эту смесь до появления колоний. Метилцеллюлоза представляет собой химически инертную, полутвердую матрицу, которая предотвращает миграцию клеток, в то время как цитокины стимулируют клетки-предшественники к дифференцировке и образованию колоний, содержащих узнаваемое потомство.
Затем окрасьте колонии с помощью йодонитротетразола хлорида или INT и инкубируйте в течение ночи, пока колонии не приобретут темно-красновато-коричневый цвет. Митохондриальные ферменты восстанавливают желтый цвет INT до красителя формазан красновато-коричневого цвета. Наконец, определите и подсчитайте колонии, присутствующие на пластине. В следующем протоколе мы проведем анализ КОЕ, чтобы проверить влияние противоопухолевых соединений на YFP-положительные клетки.
- Сначала разморозьте метилцеллюлозу с цитокинами для мышей при комнатной температуре. Затем добавьте 3 миллилитра метилцеллюлозы в пробирку FACS. Добавьте 100 микролитров клеточной суспензии с соответствующими ингибиторами в 3 миллилитра метилцеллюлозы. Затем переведите суспензию на высокую мощность в течение 10-30 секунд.
После того, как большая часть пузырьков воздуха выйдет, используйте шприц объемом 1 миллилитр, чтобы налить 1 миллилитр среды в три повторяющиеся пластины. Поместите тарелки в большую чашку Петри вместе с одной открытой миской со стерильной водой. Затем накройте большую чашку Петри, и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия.
Приготовьте морилку йодонитротетразолия хлоридом, растворив 10 миллиграммов йодонитретразолия хлорида в 10 миллилитрах воды. Фильтр стерилизуют окрашивающий раствор с помощью шприца Luer-Lok, оснащенного фильтром 0,2 мкм.
В капюшон для культуры тканей добавьте 100 микролитров красящего раствора по каплям вокруг пластины с КОЕ. Затем инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для клеточных культур. Наконец, после того, как колонии приобретут темно-красно-коричневый цвет, используйте белый фон в капюшоне для культуры стерильных тканей, чтобы сфотографировать окрашенную пластину с КОЕ.