Отрицательная иммуномагнитная селекция: метод очистки В-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови

Мононуклеарные клетки периферической крови или PBMC включают В-клетки, Т-клетки, естественные киллеры или NK-клетки, а также моноциты. В-клетки вырабатывают молекулы иммуноглобулина для борьбы с инфекцией. При лейкемии эти клетки размножаются и метастазируют в разные органы.

Чтобы изолировать В-клетки, начните с суспензии выделенных PBMC. Добавьте первичную смесь антител, направленную против специфических молекул клеточной поверхности, называемых кластером дифференцировки или CD. Специфические антитела связываются с молекулой CD-3 на Т-клетках, молекулой CD-14 на моноцитах и молекулой CD-16 на NK-клетках, оставляя В-клетки непомеченными.

Далее промойте образец, чтобы удалить несвязанные антитела. Добавьте в образец магнитные микрогранулы, сопряженные с вторичными антителами. Вторичные антитела связываются с ФК-областью первичных антител, прикрепленных к конкретным клеткам. Поместите пробирку, содержащую меченую клеточную суспензию, под воздействие магнитного поля. В полевых условиях магнитно помеченные клетки мигрируют и связываются со стенкой трубки, что приводит к отрицательному отбору нежелательных клеток. Соберите надосадочную жидкость, содержащую обогащенные В-клетки, в свежую пробирку для сбора.

В этом протоколе мы проведем отрицательную иммуномагнитную селекцию лейкозных В-клеток из PBMC пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом.

Отбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте 10 миллионов PBMC в одном миллилитре изоляционного буфера, который представляет собой PBS с 0,1% BSA и 2 миллимолярами EDTA, при этом pH отрегулирован до 7,4. В настоящее время лимфоциты ХЛЛ необходимо очищать от препаратов PBMC. Затем добавьте 10 микрограммов мышиных моноклональных анти-CD-3, CD-14 и CD-16 первичных антител и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

После промывки клеток изоляционным буфером и центрифугирования при 500-кратном g в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия ресуспендируйте 10 миллионов PBMC в 1 миллилитре изоляционного буфера. Инкубируйте ресуспендированные клетки со 100 микролитрами промытых магнитных шариков в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия с осторожной подвержкой. Затем поместите пробирку в магнитодержатель на две минуты и перенесите надосадочную жидкость с отвязанными клетками в свежую пробирку с помощью пипетки объемом 5 миллилитров. После этого этапа очищенные лимфоциты ХЛЛ готовы к использованию.