Почему эффлюкс красителя Hoechst важен для валидации мишени?

Эффлюкс красителя Hoechst позволяет идентифицировать клетки боковой популяции с высокой активностью ABC-транспортеров, которые функционально связаны с рецидивированием опухоли и химиорезистентностью. Данный эффлюкс служит функциональным показателем для валидации мишеней, участвующих в путях стволовых клеток и механизмах резистентности. Измерение низкой флуоресценции позволяет изолировать эти клетки для дальнейшего снижения рисков, связанных с мишенями в программах по поиску новых лекарственных средств.Каким образом применение верапамила способствует изоляции независимой переменной в процессе поиска?

Каким образом применение верапамила способствует изоляции независимой переменной в процессе поиска?

Верапамил блокирует ABC-транспортеры для подавления эффлюкса Hoechst, создавая контрольное условие, которое увеличивает флуоресценцию в клетках боковой популяции. Это позволяет исследователям изолировать влияние активности транспортеров как независимую переменную в анализе. Путем сравнения обработанных и необработанных образцов данный метод позволяет прояснить роль ABC-транспортеров в эффлюксе красителя и фенотипах стволовых клеток.

Какие количественные измерения зависимой переменной позволяют выделить популяцию боковых клеток (side population)?

Интенсивность флуоресценции красителя Hoechst служит количественной зависимой переменной, при этом клетки боковой популяции демонстрируют низкую флуоресценцию из-за быстрого выведения красителя. Окрашивание пропидиййодидом используется в качестве вторичного измерения для исключения мертвых клеток при анализе. Эти измерения позволяют проводить сортировку клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортера для выделения живых популяций боковой популяции на основе заданных порогов флуоресценции.

Почему требования к воспроизводимости важны для кросс-функционального взаимодействия?

Репликация обеспечивает стабильную изоляцию боковой популяции в разных экспериментах, что имеет решающее значение для надежного обмена данными между группами по поиску, скринингу и доклиническим исследованиям. Стандартизированные условия инкубации, концентрация красителя и параметры сортировки снижают вариабельность и способствуют переносимости анализа. Стабильные результаты повышают уверенность в полезности метода для валидации мишеней и идентификации ведущих соединений в различных подразделениях.

Какие возможности статистического анализа необходимы перед внедрением данного метода анализа?

Для проведения анализа требуется возможность количественного определения интенсивности флуоресценции и расчета частоты боковой популяции в процентах от общего количества живых клеток. Для подтверждения значимых различий в эффлюксе Hoechst необходимо провести статистическое сравнение между контрольной группой (обработанной верапамилом) и экспериментальными группами. Эти анализы позволяют объективно оценить активность ABC-транспортеров и ее модуляцию под воздействием экспериментальных условий.

Анализ побочных популяций: метод выделения боковой популяции опухолевых клеток у рыбок данио

JoVE Encyclopedia of Experiments

Исследования рака

0 просмотров • 4:31 мин • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Химиотерапевтическое лечение опухолей, как правило, нацелено на высокопролиферативные клетки, оставляя после себя небольшое подмножество популяции стволовых клеток, что приводит к рекапитуляции опухоли. Эти стволовые клетки называются побочной популяцией. Поскольку в популяции побочных веществ отсутствуют специфические клеточные маркеры, мы используем анализ оттока красителя, чтобы изолировать их от других опухолевых клеток.

Для начала добавьте краситель Hoechst в изолированные опухолевые клетки рыбок данио. Хёхст проникает в ядро и связывается с богатой A-T областью в малой борозде ДНК. Боковая популяция клеток имеет более высокую концентрацию транспортеров ABC на поверхности, что приводит к быстрому оттоку красителя за пределы клетки, демонстрируя низкую флуоресценцию.

Возьмите еще один флакон с опухолевыми клетками, обработанными Hoesct, и добавьте в него верапамил. Этот флакон действует как контроль, потому что верапамил блокирует транспортеры ABC, вызывая уменьшение оттока Хехста, следовательно, увеличивая флуоресценцию в популяции побочных веществ.

Инкубируйте контрольные и выборочные клетки в темноте. Затем противодействуйте окрашиванию клеток йодидом пропидия, который проникает исключительно в ядро мертвых клеток и интеркалируется между основаниями ДНК, окрашивая мертвые клетки в красный цвет. Наконец, отсортируйте клетки с помощью флуоресцентного активированного сортировщика клеток. В следующем протоколе мы выделим побочную популяцию опухолевых клеток у рыбок данио.

- Перед окрашиванием клеток разведите краситель Hoechst в воде, не содержащей нуклеаз, чтобы получить один миллиграмм на миллилитр рабочего раствора. Приготовленный раствор хранят накрытым алюминиевой фольгой при температуре 4 градуса Цельсия, затем растворяют 49,1 миллиграмма верапамила в одном миллилитре ДМСО до получения 100 микромольного раствора ингибитора.

Затем подготовьте образец, добавив FBS/PBS 2,5 микролитра ДМСО, 15 микролитров одного миллиграмма на миллилитр красителя Hoechst и 10 к шести опухолевым клеткам в пробирку FACS с конечным объемом в один миллилитр.

Для приготовления контроля добавьте FBS/PBS, 2,5 микролитра 100 миллимолярного верапамила, 15 микролитров одного миллиграмм на миллилитр красителя Hoechst. Прибавьте 10 к 6 опухолевым клеткам, с конечным объемом в один миллилитр.

Инкубируйте образец и контроль на водяной бане при температуре 28 градусов Цельсия в темноте в течение 120 минут. После инкубации поместите клетки сразу на лед и держите их в темноте.

Центрифугируйте клетки при температуре 300 °G, 4 градуса Цельсия в течение шести минут. Затем удалите надосадочную жидкость и промойте клетки одним миллилитром FBS/PBS. Еще раз вращайте ячейки при температуре 300 °G, 4 градуса Цельсия в течение шести минут.

После того, как клетки будут гранулированы, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте клетки в одном миллилитре FBS/PBS. Держите образцы при температуре 4 градуса Цельсия, до сортировки клеток. За 15 минут до сортировки клеток добавьте два микролитра одного миллиграмма на миллилитр стокового раствора йодида пропидиума на каждый миллилитр клеточной суспензии. Затем хорошо обработайте образцы вихрем.

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 15 августа 2026

Анализ побочных популяций: метод выделения боковой популяции опухолевых клеток у рыбок данио

Обзор

Основные компоненты исследования

Область науки

Теоретические основы

Цель исследования

Используемые методы

Основные результаты

Выводы

Часто задаваемые вопросы

Практическая значимость для промышленности

Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках

Ранний поиск и валидация мишени

Скрининг и разработка анализа

Трансляционные и доклинические исследования

Интеграция конвейеров и рабочих процессов

Операционное и корпоративное воздействие

Особенности реализации

Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике

Изоляция и характеристика Hoechst^Низкий CD45^{Отрицательный} Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

Использование фенотипированного бокового популяционного фенотипа ДНК для обнаружения и очистки раковых стволовых клеток от биологических образцов

Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток

Выделение флуоресцентно меченых клеток T-ALL: метод выделения клеток T-ALL от взрослых рыбок данио

Анализ популяционной дискриминации рака: метод выделения раковых стволовых клеток с помощью анализа на отток красителя Хёхста

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

Выделение Side населения в Myc-индуцированный Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз в данио рерио

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Поколение зебрафиш Ларвал Ксенотрансплант и анализ поведения опухолей

Создание ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с рыбками данио, из рака поджелудочной железы для тестирования на химиочувствительность

Анализ побочных популяций: метод выделения боковой популяции опухолевых клеток у рыбок данио

Обзор

Основные компоненты исследования

Область науки

Теоретические основы

Цель исследования

Используемые методы

Основные результаты

Выводы

Часто задаваемые вопросы

Практическая значимость для промышленности

Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках

Ранний поиск и валидация мишени

Скрининг и разработка анализа

Трансляционные и доклинические исследования

Интеграция конвейеров и рабочих процессов

Операционное и корпоративное воздействие

Особенности реализации

Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике

Изоляция и характеристика Hoechst Низкий CD45 Отрицательный Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

Использование фенотипированного бокового популяционного фенотипа ДНК для обнаружения и очистки раковых стволовых клеток от биологических образцов

Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток

Выделение флуоресцентно меченых клеток T-ALL: метод выделения клеток T-ALL от взрослых рыбок данио

Анализ популяционной дискриминации рака: метод выделения раковых стволовых клеток с помощью анализа на отток красителя Хёхста

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

Выделение Side населения в Myc-индуцированный Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз в данио рерио

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Поколение зебрафиш Ларвал Ксенотрансплант и анализ поведения опухолей

Создание ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с рыбками данио, из рака поджелудочной железы для тестирования на химиочувствительность

Изоляция и характеристика Hoechst^Низкий CD45^{Отрицательный} Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток