Name: Одиночных молекул изображений ядерного транспорта (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Изучите микроскопию одиночных молекул для визуализации ядерного транспорта в клетках HeLa. Этот метод позволяет анализировать динамику перемещения молекул через ядерные поры с высоким разрешением.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Этот проект был поддержан исследовательского потенциала повышения Грант (Bowling Green State University).

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы обеспечить надлежащее колокализации СВ и одиночные молекулы в процессе эксперимента. Кроме того, важно обеспечить высокое отношение сигнал шум, особенно, когда сигнал имеет низкий уровень из-за плохой маркировки или фотообесцвечивания. Локализация точность ограничивается фонового шума (в результате вне фокуса флуоресценции, CCD шума считывания, темнового тока и других факторов).

Одиночных молекул изображений ядерного транспорта

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Полезность флуоресценции одной молекулы подходы микроскопии было доказано, что большого воспользоваться в понимании биологических реакций в течение последнего десятилетия. Исследование молекулярных взаимодействий с высоким временным и пространственным разрешением глубоко внутри клетки остается сложной из-за изначально слабые сигналы, связанные с отдельными молекулами. Последние работы Ян и соавт. показали, что узкие поля epifluorescence микроскопия позволяет визуализировать nucleocytoplasmic транспорта на одном уровне молекулы. По единого подхода молекулы, важно кинетики, таких, как ядерное время транспортировки и эффективности, для сигнала-зависимые и независимые молекулы груза были получены. Здесь мы описали протокол для методологический подход с улучшенной пространственно-временной разрешение 0,4 мс и 12 нм. Улучшенное разрешение дало нам возможность захвата переходных активного транспорта и пассивной диффузии через события ядерные комплексы поры (NPC) в полу-неповрежденных клетках. Мы ожидаем, что этот метод будет использоваться для выяснения других обязательных и торговли событиях внутри клеток.

Одноместный микроскопии молекулы approch условии романа понимание ядерной транспорта.

Полезность методов флуоресцентной микроскопии единичных молекул была доказана как имеющая большое значение для понимания биологических реакций в течение...

Ядерная оболочка клетки содержит приблизительно 2000 ядерных поровых комплексов, которые обеспечивают транспорт водорастворимых молекул, таких как РНК, рибосомы, определенные белки, углеводы и сигнальные молекулы; путем добавления помеченных молекул-грузов в проницаемые клетки перемещение отдельных молекул через ядерную пору можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Для определения локализации, а также пространственно-временных характеристик, таких как время транспорта, эффективность импорта и экспорта и частота входа, требуются изображения в режиме таймлапс. Здравствуйте, я Алекс Ов, аспирант лаборатории микроскопии одиночных молекул кафедры биологии Университета штата Боулинг-Грин.Я Аша П. Шема, магистрантка из лаборатории одномолекулярной микроскопии. Я Джума, постдок в этой же лаборатории одномолекулярной микроскопии.Сегодня мы продемонстрируем процедуру визуализации отдельных молекул при ядерном транспорте через ядерные поровые комплексы в клетках HeLa. Мы используем эту методику в нашей лаборатории для изучения транслокации различных молекул через ядерный поровый комплекс. Итак, приступим.Для подготовки белков к эксперименту по ядерному транспорту стандартно трансформируют штамм JM 109 E. coli, экспрессирующий гены, ответственные за продукцию белков ядерного груза; клетки выращивают в среде LB и индуцируют с помощью IPTG. Когда клетки достигают логарифмической фазы с оптической плотностью от 0,7 до 0,8, культуру центрифугируют при 6 000 ×g в течение 15 минут при 4 °C, удаляют супернатант и взвешивают осадок. Затем клетки ресуспендируют в 10 мл буфера Celtic B на грамм осадка для экстракции белка, подходящего для аффинной очистки и анализа.Затем добавьте соответствующее количество коктейля протеаз в DNAs one и бета ме capto этанол. Перемешивайте смесь в темноте на льду в течение 30 минут. После этого центрифугируйте при 25,000 ×g в течение 20 минут при температуре 4 °C.После центрифугирования перенесите супернатант в новый флакон для подготовки к хроматографии. Разлейте по 400 µL никелевого NTA и ацетона в четыре микроцентрифужные пробирки. Центрифугируйте при 16,000 ×g в течение трех минут.Удалите супернатант. Затем добавьте 400 µL буфера для промывки при лизисе. Повторите предыдущие этапы промывки трижды после финальной промывки.Ресуспендируйте никелевый NTA в лизис-буфере и перенесите содержимое всех четырех пробирок в флакон с супернатантом клеток. Медленно перемешивайте полученную смесь в темном контейнере на льду в течение 60 минут. Подготовьте хроматографическую колонку Eco Pack, обернув ее фольгой для предотвращения фотообесцвечивания флуоресцентных белков.Также поместите 12 пробирок для сбора в штатив под колонку. После перемешивания смеси в течение 60 минут нанесите 10 milliliters смеси SNA с никелем NTA и дайте ей полностью пройти сквозь колонку. Приступайте к сбору фракций.Затем добавьте 10 milliliters буфера для промывки при лизисе. Дождитесь его полного прохождения. После этого добавьте 10 milliliters буфера IZO и дайте ему пройти.Продолжайте сбор фракций. Затем пропустите 0,5 milliliters элюирующего буфера; повторяйте промывку элюирующим буфером до тех пор, пока не будут собраны все 12 фракций. Чтобы определить, в какой фракции содержится самая высокая концентрация белка, нанесите четыре microliters каждой фракции на ПААГ и проведите окрашивание по Кумасси.Согласно стандартным процедурам, объедините наиболее концентрированные фракции и добавьте 500 µL в фильтр nano step с размером пор 10 kDa, предварительно промытый элюирующим буфером. Концентрируйте белок, центрифугируя при 16,000 ×g в течение пяти минут. Удалите буфер, перемешайте оставшуюся белковую фракцию и добавьте в центрифужный фильтр еще 500 µL.Повторите процедуру для всех выбранных фракций. Затем доведите конечный объем концентрированного белка примерно до 50 µL с помощью элюирующего буфера. После этого, осторожно перемешивая раствор микропипеткой и собирая его с поверхности фильтра, проведите дополнительную очистку через ионообменную и гель-фильтрационную колонки для получения сверхчистого белка, затем определите окончательную концентрацию белка.Затем пометьте молекулы-грузы избытком вспомогательного реактивного органического красителя, такого как Alexa 555 или Alexa 647. Это необходимо, так как собственную зеленую флуоресценцию GFP нельзя использовать для визуализации ядерного транспорта на уровне отдельных молекул из-за ее низкой фотостабильности и перекрытия спектра с автофлуоресценцией клеток. Помеченный белок следует разделить на несколько фракций по 25 µL и хранить при -80 °C за один день до начала экспериментов. Поместите автоклавированное покровное стекло в стерильную чашку Петри диаметром 35 мм и пипеткой нанесите на него 9 мл DMEM.Затем с помощью пипетки перенесите 1 mL клеточной культуры и равномерно распределите ее по покровному стеклу. Используемые клетки были предварительно генетически модифицированы для экспрессии мембранного белка POM 1 21, меченного GFP. Поместите чашки в инкубатор с CO2 на 12 часов.В день проведения эксперимента приступите к подготовке проточных камер. Извлеките предметное стекло с нанесенным слоем клеток из инкубатора, удалите излишки жидкости, просушите стекло, а затем закрепите его с помощью вакуумного герметика. Закрепление выполняется в алюминиевой раме собственного изготовления; при этом крайне важно следить за тем, чтобы клетки не пересохли в процессе подготовки.С помощью пластического шприца объемом 10 миллилитров нанесите две линии силикона по обеим сторонам покровного стекла, используя пинцет. Возьмите подготовленное малое покровное стекло с двумя нанесенными линиями силикона, переверните его и поместите поверх предметного стекла с нанесенным слоем клеток, затем слегка прижмите для формирования проточной камеры. Если на одном предметном стекле с клетками подготавливаются две отдельные камеры, крайне важно обеспечить герметичность уплотнения во избежание перекрестного загрязнения.Нанесите несколько линий силиконовой смазки между камерами от верхнего до нижнего края предметного стекла, чтобы изолировать их друг от друга. Также нанесите несколько линий смазки по внешним сторонам камер. Добавьте DMEM в проточную камеру, чтобы предотвратить высыхание клеток.Затем с помощью ватного тампона дважды промойте нижнюю часть предметного стекла водой, а затем дважды 100% ethanol. Установите рамку на микроскоп. Дважды промойте камеру, добавив в проточную ячейку 25 µL транспортного буфера и удалив его с помощью фильтровальной бумаги.Используя небольшой кусочек фильтровальной бумаги, приложенный к выходному отверстию, пермеабилизуйте клетки один раз в течение примерно двух минут, добавив 25 µL дигитонина; процесс пермеабилизации следует контролировать в режиме реального времени с помощью светлого поля. В завершение промойте клетки 25 µL транспортного буфера, дополненного 1,5% поливинилпирролидоном (PVP) для предотвращения осмотического набухания ядер. Найдите пермеабилизированные клетки под микроскопом и идентифицируйте ярко-зеленое флуоресцентное кольцо.Затем сфокусируйтесь на экваторе клетки и сделайте снимок перед добавлением флуоресцентных молекул-грузов. Устраните любую автофлуоресценцию, выбрав область ядерной оболочки и облучая ее гелий-неоновым лазером с длиной волны 633 нанометра до полного фотообесцвечивания. Как правило, для этого требуется более двух минут.Добавьте в проточную камеру образец меченого декстрана, разведенного в транспортном буфере с 1,5% PVP, в объеме 25 microliters и распределите его по камере, приложив фитиль из фильтровальной бумаги. Следует соблюдать осторожность при добавлении импортируемых белков-грузов в проницаемые клетки, так как фокус может быть легко нарушен любым резким движением. Включите оптический прерыватель с частотой примерно пять hertz, чтобы избежать фотообесцвечивания и обеспечить доступ новых порций не подвергшихся фотообесцвечиванию одиночных молекул к ядерной оболочке.Сразу после добавления молекул образца следует начать запись серии видеороликов, чтобы зафиксировать процесс транслокации через ядерные поровые комплексы. Для освещения траекторий транспорта перемещающихся молекул используйте гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 nanometer; при правильном выполнении данной процедуры будут видны пути их следования. Данный протокол позволяет получить серию изображений, демонстрирующих транслокацию единичных молекул груза, взаимодействующих с ядерным поровым комплексом.В данной системе используются клетки PERM. Путем отслеживания пространственных траекторий отдельных молекул декстрана можно выделить отдельные этапы диффузии через ядерную оболочку. Здесь показан процесс перемещения из цитоплазмы в ядро, при котором одна молекула декстрана (представленная красным пятном) переместилась из цитоплазмы, взаимодействовала с ядерной оболочкой (представленной зеленой линией пикселей) и оказалась в ядре.Молекула декстрана переместилась из цитоплазмы, взаимодействовала с ядерной оболочкой и вернулась обратно в цитоплазму. В этом примере молекула декстрана переместилась из ядра, взаимодействовала с ядерной оболочкой и вернулась обратно в ядро. А здесь молекула декстрана переместилась из ядра, взаимодействовала с ядерной оболочкой и оказалась в цитоплазме.Отслеживая пространственные траектории отдельных молекул декстрана, можно выделить отдельные этапы диффузии через ядерную оболочку. Траектории события, показанные синими линиями и пустыми точками, были определены и наложены на ядерную оболочку, обозначенную черной линией. Зеленая и красная линии представляют расстояние 100 nanometer от ядерной оболочки со стороны цитоплазмы и ядра соответственно.Мы только что продемонстрировали вам, как визуализировать транслокацию одиночных молекул через ядерный поровый комплекс с разрешением 10 нанометров при временном разрешении 400 микросекунд. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости достижения максимально возможного соотношения сигнал/шум, а также соблюдать особую осторожность при проведении эксперимента с одиночными молекулами, так как фокусировка может быть легко нарушена. На этом всё.Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Здесь мы описываем инструменты и методы обнаружения одиночных флуоресцентно меченных белковых молекул, взаимодействующих с одной молекулой ДНК, взвешенной между двумя оптически захваченными микросферами.

Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК

Мы описываем процедуры для обнаружения химических элементов настоящего в situ в клетки человека, а также их количественная оценка в пробирке . Этот метод хорошо подходит для любого типа клеток и особенно полезен для количественного химического анализа в одиночных клетках в vitro воздействия наночастиц оксидов металлов.

На месте Выявление и количественная оценка одноклеточного наночастиц оксидов металлов, с использованием ядерных рентгенофлуоресцентного анализа

Этот протокол описывает метод чувствительного измерения скорости передачи нуклеоцитоплазмы в моторных нейроподобных клетках NSC-34 путем количественного определения изменений в реальном времени в импорте белка NLS-NES-GFP в ядерной области.

Анализ для измерения нуклеоцитоплазматического транспорта в реальном времени в моторных нейроноподобных клетках NSC-34

Этот протокол описывает новый метод, позволяющий для количественного визуализации сложных формирования SNARE белков, основанный на передачи энергии резонанса Фёрстер и флуоресценции жизни изображений микроскопии.

Визуализация внутриклеточных SNARE людьми флуоресценции жизни изображений микроскопия

Здесь мы показываем как одной молекулы фото активированный локализации микроскопии может осуществляться на терминале двигательного нерва живой Drosophila melanogaster третий Инстар личинки.

В естественных условиях Одноместный молекула отслеживания на терминале Пресинаптический двигательного нерва дрозофилы

Мы описываем методы флуоресценции фотоактивации для анализа аксонального переноса нейрофилаций в одиночных миелинированных аксонах периферических нервов от трансгенных мышей, которые выражают фотоактивируемый белок нейрофиламента.

Изображение и анализ нейрофиламента транспорта в акцизных мышь Tibial нерва

Современные методы описывают нератиометрический подход к субкомпартментной визуализации кальция с высоким разрешением in vivo у Caenorhabditis elegans с использованием легкодоступных генетически кодируемых индикаторов кальция.

Субклеточная визуализация обработки кальция нейронами in vivo

Этот протокол описывает, как эффективно настраивать и выполнять автоматизированный анализ данных визуализации живых клеток, полученных в результате отслеживания нуклеоцитоплазматического транспорта с помощью оптогенетических инструментов.

Использование инструментов оптогенетики LEXY и LINuS и автоматизированного анализа изображений для количественной оценки динамики нуклеоцитоплазматического транспорта в живых клетках

Этот протокол предлагает эффективный рабочий процесс для микроскопии с помощью локализации одной молекулы изолированных ядер Arabidopsis с использованием оптимизированной изоляции, фиксации и маркировки для достижения надёжной наномасштабной визуализации хроматина и РНК-полимеразы II. Этот подход легко адаптируется к другим белкам, ассоциируемым с хроматином, или к модификациям гистонов для высокоразрешающей визуализации.

Упрощённый протокол для одномолекулярной локализации микроскопии в ядрах арабидопсиса

Функция мембранных белков регулируется липидный состав клеточных мембран. Это видео-статья содержит подробные сведения по форме патч использовании двухслойных электродов патч, а также как использовать грамицидина каналов, журналисты измененными свойствами мембраны.

Одноместный Методы Молекула для мониторинга изменений в двухслойных упругих свойств

Изучите микроскопию одиночных молекул для визуализации ядерного транспорта в клетках HeLa. Этот метод позволяет анализировать динамику перемещения молекул через ядерные поры с высоким разрешением.

Одиночных молекул изображений ядерного транспорта

Больше видео