Тонкие черепа Window Техника для Хронический Двухфотонное В естественных условиях Визуализация мышей микроглии в моделях Neuroinflammation

У взрослых пациентов, инфицированных ВИЧ, нейровоспаление нарушает нормальную синаптическую передачу сигналов, что приводит к нейрокогнитивному дефициту, который включает трудности с абстрактным мышлением, речевой беглостью, вниманием, обучением, усвоением новой информации и памятью. Белок HIV-1 Tat индуцирует секрецию воспалительных молекул, которые могут имитировать синаптическую дисфункцию, наблюдаемую у пациентов с ВИЧ. В данной работе для исследования нейровоспаления, индуцированного HIV-1 Tat, используются взрослые мыши, экспрессирующие GFP в мононуклеарных клетках, включая микроглию, с применением двухфотонной микроскопии через истонченный череп.

Реакции микроглии после инъекции tat можно визуализировать in vivo. Полученные изображения демонстрируют укорочение и утолщение отростков микроглии и формирование структур, напоминающих фагоцитарные чаши, а также миграцию периферических моноцитов в микрососудах головного мозга. Здравствуйте, я Дэн Маркер из лаборатории Харриса Галбарда и Центра развития и заболеваний нервной системы при Университете Рочестера.

Здравствуйте, я EF Trombley из лаборатории Эски на кафедре нейробиологии и анатомии Рочестерского университета. Здравствуйте, я Шейн Луу, также из лаборатории Эски. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру двухфотонной визуализации с использованием метода истончения черепа.

Данная процедура используется нами для изучения хронического нейровоспаления. Приступим к описанию эксперимента, представленного здесь. В нем используются мыши, экспрессирующие GFP в линиях мононуклеарных клеток, включая микроглию.

Для обеспечения нужд конкретного проекта могут быть использованы различные линии мышей. Приступайте к подготовке мыши, анестезированной фентанилом и мидазоламом, к хирургическому вмешательству. Сначала убедитесь, что животное больше не реагирует на болевые раздражители, такие как защемление хвоста.

Поместите животное на грелку, чтобы предотвратить гипотермию после наркоза. Затем нанесите на глаза животного защитную офтальмологическую мазь для поддержания их увлажненности. Все хирургические инструменты должны быть автоклавированы или стерилизованы в стеклянном бисерном стерилизаторе; дополнительно продезинфицируйте инструменты, погрузив их в 70% ethanol.

С помощью ножниц удалите шерсть с теменной области животного, затем продезинфицируйте эту область, используя 10% раствор повидон-йода и 70% этанол. Начните операцию, используя маленькие ножницы для выполнения срединного разреза кожи головы, начиная за четыре-пять миллиметров до черепа и продвигаясь вперед до уровня переднего края глаз. Этот разрез должен быть достаточно длинным, чтобы кожа не препятствовала приклеиванию пластины, которая стабилизирует голову мыши во время двухфотонной визуализации.

Затем смочите стерильный ватный тампон в 100% ethanol и просушите мембраны на поверхности черепа. Удалите их, аккуратно соскребая тонким пинцетом. Если мембраны не будут удалены, крепление головной пластины будет нестабильным.

Под бинокулярным микроскопом определите область, подлежащую истончению. Избегайте участков интереса, расположенных непосредственно над черепными швами, так как в этих зонах кости черепа менее стабильны, а лежащие под ними крупные сосуды и мозговые оболочки будут создавать помехи при визуализации области интереса в смотровом окне. Затем снова, используя ватную палочку, обработайте череп 10% раствором хлорида железа.

Нанесите тонкий слой клея Perma Bond Nine 10 по краям смотрового окна под головной пластиной. Затем приложите пластину к интересующей области черепа животного с легким нажимом для фиксации клея. С помощью шприца нанесите небольшое количество акрила по краю смотрового окна.

Наконец, нанесите небольшое количество Tite 4 54 по краям смотрового окна для предотвращения утечек. Прикрутите головную пластину к держателю для животного и проверьте стабильность закрепления под диссекционным микроскопом. При легком зондировании пинцетом череп не должен смещаться относительно головной пластины.

Нанесите каплю физиологического раствора на смотровое окно, чтобы убедиться в отсутствии утечек перед утоньшением. Просушите череп, используя стерильные ватные палочки и сжатый воздух. Выполните утоньшение черепа с помощью сверла IRF 0 0 7, установленного в микродрель.

При 4 000 RPM. Очень осторожно начните истончать круговую область диаметром от 2 до 2,5 миллиметров. Используйте только легкие выметающие движения почти параллельно черепу.

Не оказывайте прямого давления вниз. Каждые 20–30 секунд прекращайте сверление, чтобы удалить костную пыль с помощью сжатого воздуха. Такие перерывы при сверлении позволяют черепу остыть, что предотвращает термическое повреждение подлежащих тканей головного мозга.

По мере продвижения сверления обратите внимание на переход к более влажному слою губчатой кости, называемому Diplo. После достижения этого слоя соблюдайте особую осторожность при работе с сверлом. Периодически проверяйте толщину черепа, нанося физиологический раствор на тонкий участок и наблюдая через диссекционный микроскоп.

Физраствор дополнительно обеспечит отвод тепла. По мере истончения черепа становятся видны более мелкие сосуды. Используйте стоматологическое микролезвие для окончательного истончения под струей физраствора.

Микролезвие обеспечивает гораздо более выраженную тактильную обратную связь о стабильности черепа. Это позволяет выполнять значительно более тонкие препараты, чем при использовании только дрели. Оптимальная толщина черепа для визуализации составляет от 10 до 30 micrometers.

Весь процесс истончения обычно занимает от 15 до 30 минут. При создании тонкого окна в черепе несколько раз проверяйте степень истончения кости с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Четкость и глубина видимости микроглии и сосудов служат хорошим показателем того, что окно готово к проведению визуализации.

Когда окно будет готово, с помощью стеклянной пипетки диаметром 1 мм нанесите небольшую каплю акрилового клея Cy на тонкий участок черепа и осторожно опустите на него фрагмент покровного стекла. Затем слегка прижмите стекло к черепу, чтобы выдавить излишки клея, избегая образования пузырьков воздуха между ними, так как это может затруднить обзор. После высыхания с помощью микролезвия аккуратно удалите остатки клея с поверхности покровного стекла в preparation к двухфотонной визуализации.

Покройте тонкое корковое окно черепа физиологическим раствором и найдите область интереса с помощью эпифлуоресценции. Чтобы обеспечить возможность последующей визуализации этой области, сделайте снимок с помощью фотографической камеры. В данном примере используется специально сконструированный двухфотонный микроскоп с титан-сапфировым лазером, настроенным на 920 nanometers.

Флуоресценцию регистрируют с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) в режиме детектирования по всему полю и эмиссионного фильтра 581/80. На протяжении всего сеанса визуализации используется иммерсионный объектив с увеличением 20x. Установите максимальную выходную мощность лазера на объективе в диапазоне от 50 до 65 milliwatts.

Затем выберите область интереса либо в первом, либо во втором слое коры на глубине до 150 µm под поверхностью оболочки. Для облегчения повторной визуализации сделайте снимки одного и того же поля зрения при цифровом увеличении 1x, 2x и 3x. Кровеносные сосуды могут служить ориентирами, чтобы легко найти то же самое поле зрения во время последующих сеансов визуализации.

При трехкратном увеличении получите несколько Z-стеков, каждый из которых состоит из 80–90 Z-шагов с шагом 0,69 мкм, повторяя процедуру каждые пять минут в течение до 30 минут. Это обеспечит репрезентативную выборку морфологии и поведения микроглии во времени. В перерывах между получением Z-стеков проверяйте уровень физиологического раствора и глубину анестезии. При необходимости в ходе процедуры можно ввести поддерживающую дозу анестезирующего коктейля в размере одной трети от первоначальной дозы, чтобы предотвратить осаждение препарата в шприце и игле за несколько дней до инъекции.

Проведите силиконизацию внутренней поверхности иглы калибра 35 и микрошприца объемом 10 µL, набрав силиконизирующий раствор до полного заполнения иглы и шприца. Оставьте раствор в шприце на пять минут при комнатной температуре, затем удалите его из шприца, выньте поршень и дайте шприцу и игле полностью высохнуть. В завершение тщательно промойте шприц и иглу деионизированной водой.

После силиконизации шприц и иглу можно использовать более шести месяцев до необходимости повторной обработки. В день инъекции нанесите небольшую каплю раствора TAT на силиконизированный предметное стекло. С помощью силиконизированного наконечника пипетки наберите из этой капли необходимый объем раствора в микрообъемный шприц.

С помощью сверла выполните небольшую краниотомию диаметром 0.5 мм на расстоянии трех мм ростральнее или латеральнее от тонкого коркового окна черепа, через которое были получены двухфотонные изображения. Для этого осторожно истончите кость черепа, затем с помощью острого пинцета удалите тонкий слой кости.

Используя микроманипулятор, совместите иглу калибра 35 и шприц с отверстием трепанации. Затем осторожно введите иглу на глубину от 700 до 900 micrometers ниже поверхности отслойки. Введите 3 µL со скоростью 80 nL/min, используя шприцевой насос с микропроцессорным управлением.

На этом рисунке представлены микроглии, меченные GFP, визуализированные с помощью двухфотонной микроскопии после имплантации тонкого кортикального окна в черепе, примерно на 50 micrometers ниже поверхности среза. Одиночные двухфотонные срезы, полученные в нулевой день через 15–30 минут после имплантации тонкого кортикального окна, а также срезы, полученные через семь и 17 дней, демонстрируют, что окна остаются прозрачными, в то время как микроглия остается активированной даже в отсутствие воспалительных воздействий. Это подчеркивает полезность данного метода для исследования как нормальных, так и воспалительных взаимодействий между иммунными эффекторными клетками и другими типами нейрональных клеток.

In vivo Z-проекции, полученные через 6 и 24 часа после инъекции нейротоксина ВИЧ TAT, демонстрируют выраженные морфологические изменения активированной микроглии. Это дополнительно подтверждает нашу способность изучать морфологические изменения микроглии в режиме реального времени в острых и хронических моделях нейровоспаления. Мы только что продемонстрировали вам способ подготовки тонкого краниального окна и его использования для изучения нейровоспаления при выполнении данной процедуры.

Важно помнить, что при подготовке черепа следует действовать осторожно, чтобы избежать любых повреждений, вызванных самим процессом обработки. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.