Визуализация сотовый к клетке передачи ВИЧ-инфекции с помощью флуоресцентного клоны ВИЧ и жить конфокальной микроскопии

В этой процедуре используется визуализация живых клеток для визуализации переноса меченого GFP ВИЧ через вирусологические синапсы между ВИЧ-экспрессирующими CAT-клетками и неинфицированными первичными Т-клетками. Анализ переноса между клетками начинается с пересечения клеток CAT T-клеток ВИЧ GAG IG FP, инфекционного флуоресцентного клона HIV one, трансфицированных клеток кошки-придурка, экспрессирующих ВИЧ gag. Затем IG FP смешивают с мечеными C-M-T-M-R неинфицированными первичными Т-клетками и загружают в камеру визуализации, где можно наблюдать перенос меченого GFP ВИЧ через вирусологический синапс.

Полученные данные анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений, чтобы выявить детали передачи ВИЧ через вирусологические синапсы Т-клеток. Здравствуйте, меня зовут Бенджамин Дейл из лаборатории Бена Чена на медицинском факультете Медицинской школы Маунт-Синай. Меня зовут Грег МакНерни, я работаю в лаборатории доктора Томаса Хузера в Центре биофотоники NSF при Медицинском центре Калифорнийского университета в Дэвисе.

Меня зовут Диана Томпсон, я тоже из лаборатории доктора Томаса Хузера. Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации переноса клеток HIV one с помощью живой конфокальной микроскопии. В этой процедуре клетки шляпы трансфицируются инфекционным молекулярным клоном ВИЧ-инфицированного только обученного лабораторного персонала, работающего в области сертифицированной биобезопасности.

В комнатах для культивирования тканей второго уровня плюс или третьего уровня биобезопасности можно выполнять показанный здесь протокол. Работа с инфекционным ВИЧ в учреждениях визуализации должна быть одобрена местным организационным отделом биобезопасности. Поддерживайте концентрацию клеток jerk cat, которые будут использоваться в качестве донорских клеток, в концентрации от двух до 10 до 10 до 5 клеток на миллилитр.

В культуре jerk cat концентрация клеток среды более чем в восемь раз по 10 до пятой клетки на миллилитр приводит к снижению транс-эффективности. Чтобы начать процедуру, трансфектируйте пять раз по 10 к шести кошачьим клеткам вирусную плазмиду, ВИЧ кляп IGFP Используя метод поражения амакс ядра, как описано в прилагаемом письменном протоколе, дайте клеткам восстановиться за ночь. Мононуклеарные клетки периферической крови очищаются от охристых оболочек цельной человеческой крови с помощью центрифугирования с градиентом плотности FICO.

Первичные CD четыре положительные Т-клетки очищают от мононуклеарных клеток периферической крови путем отрицательного отбора с использованием набора для выделения CD четырех положительных Т-клеток. Отрицательно отобранные CD четыре положительные Т-клетки собираются из магнитной колонки и культивируются в нашем PMI с 10% FPS, который дополнен 10 единицами на миллилитр рекомбинантного человеческого IL, двумя из которых можно также аликировать выделенные первичные CD четыре положительными Т-клетками и замораживать их с помощью криогенных замораживающих контейнеров. Контейнеры для заморозки помещаются в морозильную камеру при температуре минус 70 градусов Цельсия минимум на три-четыре часа.

Затем клетки переводятся в жидкий азот для длительного хранения. Теперь, когда клетки дергающейся головки трансфицированы и выделены четыре первичных CD-положительных Т-клетки, приступайте к очистке и мечению клеток на следующий день после трансфекции. В настоящее время дергающиеся клетки экспрессируют инфекционную флуоресцентную конструкцию ВИЧ.

При работе с инфекционными образцами мы надеваем передний закрывающий лабораторный халат и две пары перчаток. Удалите клеточный мусор из трансфицированных клеток путем центрифугирования в пробирке с высокой плотностью упаковки. Сначала выложите 1,5 миллилитров флакона на дно конической тубы объемом 15 миллилитров.

Затем аккуратно наложите градиентный материал с трансфицированными ячейками в пятимиллилитровый объем нашей среды PMI. На этом этапе трансфицированные клетки шляпы способны продуцировать инфекционный ВИЧ. Таким образом, все наконечники пипеток, которые вступают в контакт с клетками, экспрессирующими ВИЧ, должны быть продезинфицированы 10% раствором отбеливателя.

Перед тем, как выбросить в контейнер в шкафу биобезопасности, закройте пробирку крышкой и распылите на внешнюю сторону пробирки раствор 70% этанола и протрите сухой салфеткой центрифугирование клеток при давлении 400 G в течение 20 минут при комнатной температуре с отрывом. После центрифугирования с помощью пипетки осторожно извлеките клетки из интерфейса фильтрующего фильтра и перенесите клетки в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Разбавьте ячейки нашей средой PMI до общего объема 15 миллилитров и центрифугируйте при 300 GS в течение 10 минут.

При комнатной температуре суспензируем гранулу в трех миллилитрах вяленой рабочей среды и перекладываем в двухсантиметровую лунку шестилуночной пластины. Поместите планшет в инкубатор для тканевых культур до тех пор, пока он не будет готов к использованию на следующий день. Вечером того же дня пометьте первичные CD четырьмя положительными Т-клетками, используемыми в качестве клеток-мишеней, чтобы отличить их от донорских клеток Первую гранулу четыре раза 10 из шести первичных CD четыре положительных Т-клеток путем вращения при давлении 400 G в течение 10 минут.

Затем промойте клетки пятью миллилитрами PBS и Resus. Суспензируйте в двух миллилитрах PBS, добавьте клеточный трекер оранжевый до конечной концентрации 1,5 микромоляра и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение минут. Когда клетки закончат инкубацию, добавьте восемь миллилитров полной среды чика и центрифугируйте при давлении 400 G в течение 10 минут.

Повторно суспендируйте клетки в трех миллилитрах полной среды, дополненной 10 единицами на миллилитр ИЛ 2 и поместите в инкубатор для тканевых культур на ночь. После ночной инкубации донорские и целевые клетки готовы к эксперименту по переносу из клетки в клетку. Прежде чем проводить эксперимент по переносу между клетками, подготовьте камеру визуализации, чтобы защитить платформу от колебаний температуры в помещении.

А чтобы блокировать фоновый свет комнаты, большой черный кожух накинут на всю тепловую установку микроскопа, создавая изолированный воздушный карман вокруг системы. Камера визуализации поддерживается на стабильной температуре 37 градусов Цельсия с помощью термостатического нагревателя с наконечником термопары типа T, расположенным рядом с образцом для температурной обратной связи. Разогрейте в течение 30 минут перед установкой образца.

Конфокальная визуализация с вращающимся диском с помощью инвертированного оптического микроскопа используется для создания 3D-конфокальных изображений межклеточного переноса ВИЧ. Все аппаратное обеспечение и сбор данных, включая Z-каскад, управляются программным обеспечением и/или IQ версии 1.8. Сканирование выполняется конфокальным блоком с вращающимся диском CS U 10, который одновременно использует более 800 конфокальных точек для значительного увеличения скорости сканирования в дополнение к его скорости. CS U 10 работает в паре с высокочувствительной камерой с умножением электронов, что позволяет быстро получать изображения при слабом освещении, что снижает как фотообесцвечивание, так и фототоксичность.

Источником флуоресцентного света является многоволновый лазер на ионах аргона, криптона. Оптический перестраиваемый фильтр Oko или OTF используется для выбора желаемых длин волн, которые в данном случае составляют 488 нанометров и 568 нанометров, при этом регулируя их мощность для дальнейшего уменьшения фотообесцвечивания и увеличения времени визуализации. A OTF быстро затворяет лазер после каждой выдержки от 15 до 30 миллисекунд, когда камера не получает изображения, избегая ненужной экспозиции во время передачи изображений с камеры E-M-C-C-D на компьютер.

Лазерный свет включен в систему вращающихся дисков с помощью четырехполосного четырехполосного дихроичного зеркального флуоресцентного излучения 4 0 5 4 88 5 6 47 Дихроичное зеркало разделено по длине волны с помощью 560 нанометрового зеркала с делителем изображения. Зеленый канал фильтруется с помощью полосового фильтра 525 на 50 нанометров, а красный канал фильтруется с помощью полосового фильтра 609 на 54 нанометра. Эти два канала проецируются рядом друг с другом на камеру E-M-C-C-D.

Пока камера визуализации нагревается, подготовьте клетки к эксперименту по переносу из клетки в клетку. Используйте гемоцитометр для подсчета Gag IGFP, экспрессирующих клетки ВИЧ. Поместите гемоцитометр в чашку Петри, чтобы избежать прямого контакта с клетками, экспрессирующими вирус.

Промойте клетки углекислым газом, независимой средой и ресуспендируйте в живых средах визуализации клеток в концентрации от одного до трех раз по 10 из семи клеток на миллилитр. Использование независимых от углекислого газа сред устраняет необходимость в климатической камере с углекислым газом. Для визуализации.

Клетки также подсчитывают, промывают и ресуспендируют меченые первичные CD четыре положительные Т-клетки, как показано только что для клеток с придурком. Затем начните перенос от клетки к клетке: смешайте 20 микролитров ВИЧ-гага IGFP, трансфицированных дюрхат-клеток, с 40 микролитрами меченых первичных CD четырех положительных Т-клеток и загрузите 50 микролитров в культуру ткани, обработанную газопроницаемостью. Микрокамера EBD герметизирует камеру заглушками и закрепила заглушки, обернув интерфейс камеры EBIT D параформом.

Протрите камеру визуализации химической салфеткой, смоченной с 70% этанолом, и дайте ей ненадолго высохнуть на воздухе в капюшоне. Транспортируйте герметичную камеру визуализации в герметичном контейнере, чтобы избежать случайного воздействия. Если камера упала при транспортировке сразу после загрузки камеры визуализации IBD элементами, установите устройство на микроскоп.

Делайте снимки пар ячеек с помощью масляного иммерсионного объектива с разрешением 60 x 1,42 NA, так как высокая числовая апертура значительно повышает разрешение, что позволяет максимально увеличить скорость получения данных из каждого стека 3D-изображений. Обрежьте область записи камеры EM CD до непосредственной области от пары ячеек. Кроме того, большой шаг Z между 0,45 и 0,75 микрометра также может помочь ускорить сбор данных в этих условиях.

Изображения записываются непрерывно с интервалом от 20 до 60 минут. Повторная визуализация одного и того же пятна образца может продолжаться до шести часов с минимальным фотообесцвечиванием после получения. Каждый сегмент данных состоит из десятков тысяч изображений, которые могут занимать в общей сложности от пяти до 20 гигабайт.

Чтобы облегчить транспортировку и анализ больших файлов, каждый файл разбивается и экспортируется в виде сегментов файла изображения TIFF размером в один гигабайт. Для анализа полученных изображений используйте любую из нескольких программ для анализа изображений. Обратитесь к прилагаемому письменному протоколу для получения подробной информации об анализе изображений, включая коррекцию интенсивности отбеливания и автоматическое и ручное отслеживание кляпа в точках.

В течение 10-15 минут после смешивания можно визуализировать ВИЧ-гаг IGFP, экспрессирующий клетки придурка, прилипшие к первичной визуализации CD четырех положительных Т-клеток. С помощью этих конъюгатов можно оценить движения gag puncta как в инфицированных клетках, так и в клетках-мишенях. После синапса, в течение от 30 минут до трех часов, можно наблюдать перемещение gag IG FP puncta в клетки-мишени, помеченные клеточным трекером.

Мы только что показали вам, как визуализировать передачу ВИЧ между клетками от клетки к клетке. При выполнении этих процедур очень важно помнить о соблюдении всех мер предосторожности уровня биобезопасности два плюс или уровня биобезопасности три при работе с образцами, которые подвергались воздействию клеток, экспрессирующих ВИЧ. Также не забывайте использовать хорошо ухоженные клетки JCA и свободную от эндотоксинов ДНК для оптимизации трансфекта.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.