Визуализация сотовый к клетке передачи ВИЧ-инфекции с помощью флуоресцентного клоны ВИЧ и жить конфокальной микроскопии

В данной процедуре используется визуализация живых клеток для наблюдения за переносом меченого GFP ВИЧ через вирологические синапсы между экспрессирующими ВИЧ Т-клетками кошек породы jerk CAT и неинфицированными первичными Т-клетками. Анализ межклеточного переноса начинается с трансфекции Т-клеток кошек породы jerk CAT с помощью HIV gag IG FP — инфекционного флуоресцентного клона ВИЧ-1; трансфектированные клетки кошек экспрессируют HIV gag IG FP. Затем эти клетки смешивают с неинфицированными первичными Т-клетками, мечеными C-M-T-M-R, и помещают в камеру для визуализации, где можно наблюдать перенос меченого GFP ВИЧ через вирологический синапс.

Полученные данные анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений, чтобы выявить детали переноса ВИЧ через вирологические синапсы Т-клеток. Здравствуйте, меня зовут Бенджамин Дейл, я из лаборатории Бена Чена с кафедры медицины медицинской школы Маунт-Синай. Меня зовут Грег МакНерни, я из лаборатории доктора Томаса Хьюзера в Центре биофотоники NSF при медицинском центре Калифорнийского университета в Дейвисе.

А я Дианна Томпсон, также из лаборатории доктора Томаса Хьюзера. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру визуализации межклеточного переноса HIV-1 с помощью конфокальной микроскопии живых клеток. В данной процедуре клетки Jurkat трансфицируют инфекционным молекулярным клоном HIV-1; процедуру должен выполнять только обученный лабораторный персонал, работающий в сертифицированных условиях биобезопасности.

Данный протокол может быть реализован в помещениях для культивирования тканей уровня биобезопасности 2+ или 3. Работа с инфекционным ВИЧ в центрах визуализации должна быть одобрена местным институциональным отделом по биобезопасности. Поддерживайте клетки jerk cat, используемые в качестве донорских клеток, при концентрации от 2×10⁵ до 8×10⁵ клеток/мл.

При культивировании клеток JERK cat концентрация клеток в среде, превышающая 8 × 10⁵ клеток/мл, приводит к снижению эффективности трансфекции. Для начала процедуры трансfect 5 × 10⁶ клеток JERK cat вирусной плазмидой HIV gag IGFP, используя метод нуклеофекции Amaxa, как описано в прилагаемом письменном протоколе; дайте клеткам восстановиться в течение ночи. Мононуклеарные клетки периферической крови очищают из лейкоцитарного слоя цельной крови человека методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll.

Первичные CD4-положительные Т-клетки очищают из мононуклеарных клеток периферической крови методом негативного отбора с использованием набора для изоляции CD4-положительных Т-клеток. Очищенные методом негативного отбора CD4-положительные Т-клетки собирают с магнитной колонки и культивируют в нашей PMI с 10% FPS, дополненной 10 units/mL рекомбинантного человеческого IL-2. Также можно разделить изолированные первичные CD4-положительные Т-клетки на аликвоты и заморозить их с помощью криоконтейнеров. Криоконтейнеры помещают в морозильную камеру при температуре -70 °C минимум на три-четыре часа.

Затем клетки переносят в жидкий азот для длительного хранения. После того как клетки Jurkat были трансфицированы, а целевые первичные CD4-положительные Т-клетки изолированы, на следующий день после трансфекции переходят к очистке и маркировке клеток. Теперь клетки Jurkat экспрессируют инфекционную флуоресцентную конструкцию ВИЧ.

При работе с инфекционными образцами следует использовать лабораторный халат с застежкой спереди и две пары перчаток. Удалите клеточный дебрис из трансфицированных клеток путем центрифугирования через среду Ficoll с высокой плотностью. Сначала внесите 1,5 мл Ficoll на дно конической пробирки объемом 15 мл.

Затем аккуратно нанесите поверх градиентного материала трансфицированные клетки jerk hat в объеме 5 мл среды PMI. На этом этапе трансфицированные клетки jerk hat способны вырабатывать инфекционный ВИЧ. Поэтому все наконечники для пипеток, которые контактируют с клетками, экспрессирующими ВИЧ, должны быть продезинфицированы 10% раствором отбеливателя.

Перед тем как выбросить пробирку в контейнер внутри бокса биологической безопасности, закройте ее крышкой, обработайте внешнюю поверхность пробирки 70% раствором этанола и протрите сухой салфеткой Kimwipe; центрифугируйте клетки при 400 G в течение 20 минут при комнатной температуре с выключенным торможением. После центрифугирования с помощью пипетки аккуратно удалите клетки из интерфейса между осадком и средой и перенесите их в новую коническую пробирку объемом 15 мл. Разбавьте клетки средой PMI до общего объема 15 мл и центрифугируйте при 300 G в течение 10 минут.

При комнатной температуре мы суспендируем осадок в трех миллилитрах среды для культивирования клеток HEK293 и переносим в лунку объемом два сантиметра шестилуночного планшета. Поместите планшет в инкубатор для культивирования тканей до использования на следующий день. Вечером того же дня пометьте первичные CD4-положительные Т-клетки, используемые в качестве таргетных клеток, чтобы отличить их от донорских клеток. Сначала осадите 4 × 10⁶ первичных CD4-положительных Т-клеток, центрифугируя при 400 G в течение 10 минут.

Затем промойте клетки пятью миллилитрами PBS и ресуспендируйте в двух миллилитрах PBS; добавьте краситель Cell Tracker Orange до конечной концентрации 1,5 мкМ и инкубируйте при 37 °C в течение нескольких минут. После завершения инкубации добавьте восемь миллилитрами полной среды chica и центрифугируйте при 400 ×g в течение 10 минут.

Ресуспендируйте клетки в трех миллилитрах полной среды с добавлением 10 units/mL IL-2 и поместите в инкубатор для культивирования тканей на ночь. После инкубации в течение ночи донорские и таргетные клетки будут готовы к эксперименту по переносу из клетки в клетку. Перед началом эксперимента по переносу из клетки в клетку подготовьте камеру для визуализации, чтобы защитить платформу от температурных колебаний в помещении.

Чтобы исключить воздействие фонового освещения в помещении, вся установка микроскопа с системой нагрева накрывается большим черным чехлом, создающим вокруг системы изолированный воздушный карман. В камере для визуализации поддерживается стабильная температура 37 °C с помощью термостатического нагревателя с термопарой типа T, установленной рядом с образцом для обратной связи по температуре. Перед установкой образца необходимо произвести предварительный нагрев в течение 30 минут.

Конфокальная визуализация с вращающимся диском с использованием перевернутого оптического микроскопа применяется для создания 3D-конфокальных изображений передачи ВИЧ от клетки к клетке. Все оборудование и процесс сбора данных, включая Z-стек, контролируются программным обеспечением IQ версии 1.8; сканирование выполняется с помощью конфокального модуля с вращающимся диском CS U 10, который одновременно использует более 800 конфокальных точек для значительного увеличения скорости сканирования. CS U 10 сопряжен с высокочувствительной камерой на основе прибора с зарядовым перемещением с электронным умножением, что позволяет проводить быструю визуализацию при слабом освещении, снижая тем самым как фотообесцвечивание, так и фототоксичность.

Источником флуоресцентного света является многоволновой аргон-криптоновый ионный газовый лазер. Для выбора необходимых длин волн, которые в данном случае составляют 488 nanometers и 568 nanometers, используется акустооптический перестраиваемый фильтр (A OTF), который также позволяет контролировать мощность излучения для дальнейшего снижения фотовыцветания и увеличения времени визуализации. A OTF быстро перекрывает лазерный луч после каждой экспозиции длительностью от 15 до 30 millisecond, когда камера не осуществляет захват изображений, что позволяет избежать ненужного облучения во время передачи изображений с E-M-C-C-D камеры на компьютер.

Лазерный свет вводится в систему с вращающимся диском с помощью четырехполосного дихроичного зеркала 405/488/568/647; флуоресцентное излучение разделяется по длине волны с помощью дихроичного зеркала с длинноволновым пропуском 560 нм и разделителя изображений. Зеленый канал фильтруется с помощью полосового фильтра 525/50 нм, а красный канал — с помощью полосового фильтра 609/54 нм. Оба канала проецируются рядом друг с другом на EMCCD-камеру.

Пока камера для визуализации прогревается, подготовьте клетки для эксперимента по переносу из клетки в клетку. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток ette, экспрессирующих HIV gag IGFP. Поместите гемоцитометр в чашку Петри, чтобы избежать прямого контакта с клетками, экспрессирующими вирус.

Промойте клетки среду, не требующую содержания диоксида углерода, и ресуспендируйте их в среде для визуализации живых клеток до концентрации от 1 до 3 × 10⁷ клеток на мл. Использование среды, не требующей содержания диоксида углерода, устраняет необходимость в использовании камеры с контролируемым содержанием CO₂ для визуализации.

Также подсчитайте, промойте и ресуспендируйте меченые первичные CD4-положительные T-клетки, как было показано ранее для клеток Jurkat. Затем инициируйте перенос клеток от клетки к клетке: смешайте 20 µL трансфицированных HIV gag IGFP клетками Jurkat с 40 µL меченых первичных CD4-положительных T-клеток и внесите 50 µL в газопроницаемую микрокамеру EBD, обработанную для культивирования тканей. Закройте камеру пробками и зафиксируйте их, обмотав парафильмом место соединения пробки и камеры EBD.

Протрите камеру для визуализации салфеткой, смоченной в 70% этаноле, и дайте ей ненадолго высохнуть на воздухе в вытяжном шкафу. Переносите герметичную камеру для визуализации в закрытом контейнере, чтобы избежать случайного воздействия. Если камера была уронена при транспортировке, немедленно после загрузки клеток в камеру для визуализации IBD установите устройство на микроскоп.

Снимайте изображения пар клеток, используя иммерсионный объектив 60 x 1.42 NA; высокая числовая апертура значительно улучшает разрешение, что позволяет максимально увеличить скорость сбора данных для 3D-стеков изображений. Обрежьте область записи камеры EM CD до непосредственной области вокруг пары клеток. Кроме того, большой шаг по оси Z в диапазоне от 0,45 до 0,75 мкм также может помочь ускорить сбор данных в данных условиях.

Изображения непрерывно регистрируются с интервалами от 20 до 60 минут. Повторная визуализация одной и той же области образца может продолжаться до шести часов с минимальным фотообесцвечиванием при сборе данных. Каждый сегмент данных состоит из десятков тысяч изображений, общий объем которых может составлять от 5 до 20 гигабайт.

Для облегчения транспортировки и анализа больших файлов каждый файл разделяется и экспортируется в виде сегментов TIFF-изображений размером в один гигабайт. Для анализа полученных изображений используйте любую из нескольких программ для анализа изображений. Подробную информацию по анализу изображений, включая коррекцию выгорания интенсивности, а также автоматическое и ручное отслеживание пунктов gag, см. в прилагаемом письменном протоколе.

Через 10–15 минут после смешивания можно визуализировать адгезию клеток JERK cat, экспрессирующих HIV gag IGFP, к первичным CD4-положительным Т-клеткам. На этих конъюгатах можно оценить перемещение пунктат gag в инфицированных, а также в клетках-мишенях. После формирования синапса, в интервале от 30 минут до трех часов, можно наблюдать перемещение пунктат gag IGFP в клетки-мишени, помеченные CellTracker.

Мы только что продемонстрировали вам способ визуализации переноса ВИЧ из клетки в клетку между Т-лимфоцитами. При выполнении этих процедур очень важно соблюдать все меры предосторожности второго повышенного (BSL-2+) или третьего (BSL-3) уровня биобезопасности при работе с образцами, подвергшимися воздействию клеток, экспрессирующих ВИЧ. Также помните о необходимости использовать правильно поддерживаемые клетки JCA и свободную от эндотоксинов ДНК для оптимизации трансфекции.

На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.