Визуализация сотовый к клетке передачи ВИЧ-инфекции с помощью флуоресцентного клоны ВИЧ и жить конфокальной микроскопии

В данной процедуре используется визуализация живых клеток для наблюдения за переносом HIV, меченного GFP, через вирологические синапсы между экспрессирующими HIV T-клетками кошки (jerk CAT T cells) и неинфицированными первичными T-клетками. Анализ межклеточного переноса начинается с трансфекции T-клеток кошки (jerk CAT T cells) с помощью HIV gag IG FP, инфекционного флуоресцентного клона HIV-1; трансфецированные клетки кошки экспрессируют HIV gag IG FP. Затем их смешивают с неинфицированными первичными T-клетками, меченными C-M-T-M-R, и помещают в камеру для визуализации, где можно наблюдать перенос HIV, меченного GFP, через вирологический синапс.

Полученные данные анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений, чтобы выявить детали переноса ВИЧ через вирологические синапсы Т-клеток. Здравствуйте, меня зовут Бенджамин Дейл, я из лаборатории Бена Чена на кафедре медицины в Медицинской школе Маунт-Синай. Меня зовут Грег МакНерни, я из лаборатории доктора Томаса Хьюзера в Центре биофотоники NSF при Медицинском центре Калифорнийского университета в Дэвисе.

А я — Дианна Томпсон, также из лаборатории доктора Томаса Хьюзера. Сегодня мы продемонстрируем процедуру визуализации межклеточного переноса HIV-1 с помощью конфокальной микроскопии живых клеток. В данной процедуре клетки Jurkat трансфицируют инфекционным молекулярным клоном HIV-1; работа должна проводиться только обученным лабораторным персоналом в сертифицированных условиях биологической безопасности.

Протокол, описанный здесь, может быть выполнен в помещениях для культивирования тканей уровня биобезопасности 2+ или 3. Работа с инфекционным ВИЧ в центрах визуализации должна быть одобрена местным институциональным отделом по биобезопасности. Поддерживайте клетки jerk cat, используемые в качестве донорских клеток, при концентрации от 2×10⁵ до 8×10⁵ клеток/мл.

При культивировании клеток Jurkat концентрация клеток в среде, превышающая 8 × 10⁵ клеток/мл, приводит к снижению эффективности трансфекции. Для начала процедуры трансфицируйте 5 × 10⁶ клеток Jurkat вирусной плазмидой HIV gag IGFP с помощью метода Amaxa Nucleofection, как описано в прилагаемом письменном протоколе, и оставьте клетки для восстановления на ночь. Мононуклеарные клетки периферической крови очищают из лейкоцитарного слоя цельной человеческой крови методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll.

Первичные CD4+ Т-клетки выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови методом негативной селекции с использованием набора для изоляции CD4+ Т-клеток. Негативно селектированные CD4+ Т-клетки собирают с магнитной колонки и культивируют в среде PMI с 10% FBS, дополненной 10 units/mL рекомбинантного человеческого IL-2. Также изолированные первичные CD4+ Т-клетки можно разделить на аликвоты и заморозить с помощью криоконтейнеров. Криоконтейнеры помещают в морозильную камеру при температуре -70 °C минимум на три-четыре часа.

Затем клетки переносят в жидкий азот для длительного хранения. Теперь, когда клетки Jurkat трансфецированы, а целевые первичные CD4-положительные T-клетки изолированы, на следующий день после трансфекции следует приступить к очистке и маркировке клеток. Клетки Jurkat теперь экспрессируют инфекционную флуоресцентную конструкцию HIV.

При работе с инфекционными образцами мы используем лабораторный халат с застежкой спереди и две пары перчаток. Удалите клеточный дебрис из трансфицированных клеток путем центрифугирования через среду с высокой плотностью упаковки fial. Сначала внесите 1.5 milliliters fial pack на дно конической пробирки объемом 15 milliliters.

Затем осторожно нанесите сверху на градиентный материал трансфицированные клетки JER-Hat в объеме 5 мл среды PMI. На данном этапе трансфицированные клетки JER-Hat способны продуцировать инфекционный ВИЧ. Поэтому все наконечники дозаторов, которые контактировали с клетками, экспрессирующими ВИЧ, должны быть продезинфицированы 10% раствором отбеливателя.

Перед тем как выбросить пробирку в контейнер внутри бокса биологической безопасности, закройте её крышкой, обработайте внешнюю поверхность пробирки 70% ethanol и протрите сухой салфеткой Kimwipe. Центрифугируйте клетки при 400 Gs в течение 20 минут при комнатной температуре с отключенным торможением. После центрифугирования осторожно удалите клетки с границы раздела сред из флакона с помощью пипетки и перенесите их в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Разбавьте клетки средой PMI до общего объема 15 миллилитров и центрифугируйте при 300 GS в течение 10 минут.

При комнатной температуре мы суспендируем осадок в трех миллилитрах среды для культивирования клеток и переносим в лунку объемом 2 см шестилуночного планшета. Поместите планшет в инкубатор для культур тканей до использования на следующий день. Вечером того же дня пометьте первичные CD4-положительные T-клетки, используемые в качестве клеток-мишеней, чтобы отличить их от донорских клеток. Сначала осадите 4 × 10⁶ первичных CD4-положительных T-клеток, центрифугируя при 400 ×g в течение 10 минут.

Затем промойте клетки пятью миллилитрами PBS и ресуспендируйте в двух миллилитрах PBS, добавьте краситель CellTracker Orange до конечной концентрации 1.5 µM и инкубируйте при 37 °C в течение нескольких минут. По завершении инкубации клеток добавьте восемь миллилитров полной среды для cultured cells и центрифугируйте при 400 ×g в течение 10 минут.

Ресуспендируйте клетки в трех миллилитрах полной среды, дополненной 10 units per milliliter IL 2, и поместите в инкубатор для культивирования тканей на ночь. После инкубации в течение ночи донорские и таргетные клетки готовы к эксперименту по переносу от клетки к клетке. Перед началом эксперимента по переносу от клетки к клетке подготовьте камеру для визуализации, чтобы защитить платформу от температурных колебаний в помещении.

Чтобы исключить влияние фонового освещения в помещении, вся установка для нагрева микроскопа накрывается большим черным кожухом, создающим вокруг системы изолированную воздушную прослойку. В камере для визуализации поддерживается стабильная температура 37 °C с помощью термостатического нагревателя с термопарой типа T, расположенной рядом с образцом для обратной связи по температуре. Перед установкой образца проведите предварительный нагрев в течение 30 минут.

Для создания трехмерных конфокальных изображений переноса ВИЧ от клетки к клетке используется конфокальная микроскопия с вращающимся диском на инвертированном оптическом микроскопе. Все оборудование и процесс сбора данных, включая перемещение по оси Z, контролируются программным обеспечением IQ версии 1.8. Сканирование осуществляется с помощью конфокального модуля с вращающимся диском CS U 10, который одновременно использует более 800 конфокальных точек, что значительно увеличивает скорость сканирования. Модуль CS U 10 сопряжен с высокочувствительной камерой на основе прибора с зарядом с электронным умножением, что позволяет проводить быструю съемку при слабом освещении, снижая тем самым как фотовыгорание, так и фототоксичность.

Источником флуоресцентного освещения служит многоволновой аргон-криптоновый ионный газовый лазер. Для выбора необходимых длин волн, которые в данном случае составляют 488 nanometers и 568 nanometers, используется акустооптический перестраиваемый фильтр (AOTF); он также позволяет регулировать мощность излучения для дополнительного снижения фотообесцвечивания и увеличения времени визуализации. AOTF быстро перекрывает лазерный луч после каждой экспозиции длительностью от 15 to 30 millisecond в моменты, когда камера не ведет захват изображений, что позволяет избежать избыточного облучения во время передачи данных с E-M-C-C-D камеры на компьютер.

Лазерный свет вводится в систему со вращающимся диском с помощью четырехполосного дихроичного зеркала 405/488/561/647; флуоресцентное излучение разделяется по длине волны с использованием длинноволнового дихроичного зеркала 560 нм и разделителя изображений. Зеленый канал фильтруется с помощью полосового фильтра 525/50 нм, а красный канал — с помощью полосового фильтра 609/54 нм. Оба канала проецируются параллельно на EMCCD-камеру.

Пока камера для визуализации прогревается, подготовьте клетки для эксперимента по переносу от клетки к клетке. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток ette, экспрессирующих HIV gag IGFP. Поместите гемоцитометр в чашку Петри, чтобы избежать прямого контакта с клетками, экспрессирующими вирус.

Промойте клетки средой, не требующей содержания углекислого газа, и ресуспендируйте их в среде для имиджинга живых клеток до концентрации от 1 до 3 × 10⁷ клеток на мл. Использование среды, не требующей содержания углекислого газа, избавляет от необходимости использования камеры с контролируемым содержанием CO₂ для проведения визуализации.

Клетки также подсчитывают, промывают и ресуспендируют меченые первичные CD4-положительные T-клетки, как было показано ранее для клеток Jurkat. Затем инициируют перенос клеток из одной клетки в другую: смешивают 20 µL трансфицированных HIV gag-GFP клетками Jurkat с 40 µL меченых первичных CD4-положительных T-клеток и загружают 50 µL в газопроницаемую микрокамеру EBD, обработанную для культивирования тканей. Камеру закрывают пробками, а затем фиксируют пробки, обматывая интерфейс пробки и камеры EBD парафильмом.

Протрите камеру для визуализации безворсовой салфеткой, смоченной 70% ethanol, и дайте ей ненадолго высохнуть на воздухе в вытяжном шкафу. Переносите герметичную камеру для визуализации в закрытом контейнере, чтобы избежать случайного воздействия. В случае падения камеры при транспортировке, сразу после загрузки клеток в камеру для визуализации IBD, установите устройство на микроскоп.

Снимайте изображения пар клеток, используя иммерсионный масляный объектив 60 x 1.42 NA, так как высокая числовая апертура значительно повышает разрешение, что позволяет максимально увеличить скорость получения 3D-стеков изображений. Обрежьте область записи камеры EM CD до непосредственной зоны расположения пары клеток. Кроме того, в данных условиях для ускорения процесса сбора данных может помочь большой шаг по оси Z в диапазоне от 0.45 до 0.75 micrometers.

Изображения записываются непрерывно с интервалом от 20 до 60 минут. Повторная визуализация одной и той же области образца может продолжаться до шести часов с минимальным фотообесцвечиванием при сборе данных. Каждый сегмент данных состоит из десятков тысяч изображений, которые могут занимать в общей сложности от 5 до 20 гигабайт.

Для облегчения транспортировки и анализа больших файлов каждый из них разделен и экспортирован в виде сегментов TIFF-изображений размером по одному гигабайту. Для анализа полученных изображений используйте любую из нескольких программ для анализа изображений. Подробную информацию по анализу изображений, включая коррекцию выгорания интенсивности, а также автоматический и ручной трекинг пунктат Gag, смотрите в прилагаемом письменном протоколе.

Через 10–15 минут после смешивания можно визуализировать прикрепление клеток JER-Cat, экспрессирующих HIV gag-IGFP, к первичным CD4-положительным Т-клеткам. На этих конъюгатах можно оценивать перемещение пунктат gag как в инфицированных, так и в клетках-мишенях. После формирования синапса, в интервале от 30 минут до трех часов, можно наблюдать перемещение пунктат gag-IGFP в клетки-мишени, маркированные CellTracker.

Мы только что продемонстрировали вам способ визуализации переноса ВИЧ из клетки в клетку между T-лимфоцитами. При выполнении этих процедур крайне важно соблюдать все меры предосторожности второго повышенного (BSL-2+) или третьего (BSL-3) уровней биологической безопасности при работе с образцами, подвергавшимися воздействию экспрессирующих ВИЧ клеток. Также помните о необходимости использовать правильно культивируемые клетки JCA и свободную от эндотоксинов ДНК для оптимизации трансфекции.

На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.