Сайленсинг генов in vitro на основе обратной трансфекции миРНК: процедура доставки малых интерферирующих РНК в культивируемые клетки для инактивации экспрессии генов-мишеней

Для обратной трансфекции малых интерферирующих РНК, или миРНК, класса двухцепочечных РНК, в неадгезивные адипоциты или жировые клетки, готовят суспензию миРНК, нацеленную на специфический ген, кодирующий белки в адипоцитах. Добавьте подходящий реагент для трансфекции на основе катионных липидов. Инкубируйте смесь для образования трансфекционных комплексов путем электростатических взаимодействий.

Переложите смесь в покрытые коллагеном лунки многолуночной пластины. Трансфекционные комплексы иммобилизуются на покрытии пластины за счет неспецифических взаимодействий. Пипеткой введите суспензию адипоцитов в лунки, содержащие иммобилизованные трансфекционные комплексы. Адипоциты неплотно прилипают к покрытию пластины, увеличивая физический контакт между клетками и комплексами.

Трансфекционный комплекс сливается с клеточной мембраной и доставляет миРНК в цитоплазму. МиРНК, содержащая антисмысловую цепь с комплементарной последовательностью для целевой мРНК и сенсорную цепь, распознается мультибелковым РНК-индуцирующим сайленсингирующим комплексом, или RISC. МиРНК связывается с RISC, и нити отделяются, при этом антисмысловая цепь остается связанной с комплексом.

Активированный комплекс миРНК-RISC распознает и связывается с комплементарными сайтами на целевой мРНК. Это приводит к секвенс-специфическому расщеплению мРНК белком аргонавта комплекса RISC. Расщепленная мРНК еще больше разрушается клеточным механизмом, тем самым подавляя экспрессию генов-мишеней.