Северный блот для обнаружения и количественного определения специфической микроРНК в экстракте общей РНК растительной ткани

МикроРНК, микроРНК, представляют собой небольшие одноцепочечные, некодирующие РНК. МикроРНК объединяются в мультибелковый комплекс и в дальнейшем связываются с комплементарными последовательностями мРНК-мишеней для негативной регуляции экспрессии генов.

Чтобы обнаружить специфическую микроРНК из общей РНК из растительных тканей, добавьте гелеобразующий краситель, содержащий трекинговые красители и формамид — РНК-денатурирующее средство. Нагрейте образец, чтобы денатурировать РНК и предотвратить образование вторичной структуры перед электрофорезом.

Загрузите образец и стандартные маркеры РНК в лунки предварительно собранного денатурирующего полиакриламидного геля. Запустите электрофорез, облегчающий разделение фрагментов РНК по размеру.

Перенесите гель на предварительно смоченную фильтровальную бумагу на кассете для электроблоттинга. Направьте на гель пропитанную буфером капроновую промокательную пленку. Затем сложите предварительно смоченную фильтровальную бумагу. Проведите электроблоттинг.

Электрический ток заставляет отрицательно заряженную РНК, в том числе микроРНК, перемещаться из геля на положительно заряженную поверхность нейлоновой мембраны. Подвергать мембрану воздействию ультрафиолета; это сшивает РНК с мембраной, тем самым предотвращая потерю РНК.

Инкубируйте мембрану в гибридизационном буфере, содержащем блокаторы, которые занимают неспецифические участки связывания для снижения фонового шума.

Добавьте радиоактивно меченный РНК-олигонуклеотидный зонд, комплементарный микроРНК, чтобы специфически связываться с ней. Промойте мембрану буфером, удалив несвязанные щупы.

Используйте систему люминофорной визуализации для обнаружения и количественной оценки интенсивности сигнала радиоактивной гибридизации. Сигнал с высоким разрешением указывает на специфическую экспрессию микроРНК в тканях растения.