В естественных условиях Визуализация синаптических пузырьков В дрозофилы личинок Сегментные Аксоны
15 октября 2010 г.
Этот протокол рассматривается жить рассечение Drosophila Личинок для визуализации движения GFP меткой аксонального пузырьки на микротрубочки треков.
Целью данной работы является изучение того, присутствуют ли нарушения аксонального транспорта на большие расстояния при таких неврологических заболеваниях, как болезнь Альцгеймера или болезнь Гентингтона. Визуализация аксонального транспорта транспортных везикул проводится в живой лаве пищевода. Здесь представлены результаты.
В-третьих, личинки звездчатых нейронов, экспрессирующие белок синапсин, меченный A GFP, препарируют на гелевом кубике, затем переносят под микроскоп для визуализации in vivo. С помощью флуоресцентной микроскопии отслеживают аксональный транспорт внутри аксона. Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами является возможность визуализировать непрерывное движение синаптических пузырьков в живых аксонах личинок.
Подготовьтесь к диссекции, убедившись, что следующие материалы и реагенты находятся под рукой. Буфер для диссекции. Кубик из силикона (Sill guard) размером 1 дюйм в ширину, 1 дюйм в длину и 1 см в высоту, помещенный на предметное стекло.
Сверхкороткие булавки для диссекции. Острая нижняя часть булавок Manum лучше всего подходит для проведения диссекции. Необходимая длина достигается путем введения более длинных булавок в гель и отрезания выступающей части булавки.
Вам также понадобится одна пара острых ножниц для микродиссекции и два набора тонких пинцетов. Используйте небольшой металлический шпатель, чтобы перенести третьего instar личинок звезды, экспрессирующих белок SLE с GFP-меткой, в чашку Петри.
Затем смойте деионизированной водой остатки корма с личинок в чашке Петри. После этого с помощью пинцета перенесите их на кубик диссекционного геля для проведения живой диссекции. Используйте пинцет, чтобы перенести личинку на кубик диссекционного геля.
На предметное стекло нанесите буфер для диссекции так, чтобы образец был полностью погружен в него. Затем закрепите личинку булавками за передним и задним концами, расположив ее спинной стороной вверх. С помощью ножниц для микродиссекции сделайте небольшой разрез по срединной линии рядом с задним концом.
От этого разреза сделайте еще один разрез до передней части. Кишечник и жировые тела вывалятся наружу; зафиксируйте их с помощью двух булавок. Закрепите разрезанную кутикулу за боковые края на фиксирующем кубе из силикона.
С помощью пипетки добавьте каплю препарирующего буфера. Затем осторожно удалите кишечник и жировые тела с помощью пинцета. Приложите салфетку Kimwipe к одной стороне личинки, чтобы удалить буфер, одновременно добавляя свежий препарирующий буфер с помощью пипетки.
Лава не должна пересыхать. Для маркировки митохондриальных или лизосомальных структур в лаве замените диссекционный буфер на диссекционный буфер, содержащий mito tracker или lyo tracker. Поместите диссекционный куб в квадратную увлажненную камеру и накройте его алюминиевой фольгой.
Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. После инкубации с маркером in vivo несколько раз удалите буфер для диссекции, окружающий личинок, и с помощью пипетки добавьте свежий буфер для диссекции. Повторите эту процедуру пять раз, чтобы смыть остатки маркера.
После замены последнего промывочного раствора полностью вдавите булавки в S-образный фиксатор и немедленно накройте образец покровным стеклом, чтобы предотвратить движение личинки. Теперь личинка готова к наблюдению. Для проведения прижизненной визуализации препарированной личинки поместите образец на предметный столик инвертированного микроскопа для получения изображений меченых везикул.
В сегментарных нервах личинки. Проведите визуализацию с использованием объектива с 100-кратным увеличением. При наличии выраженного окрашивания GFP в телах клеток на изображении вентрального ганглия и в сегментарных нервах, используя систему двойного обзора с фильтрами для C-F-P-Y-F-P или R-F-P-Y-F-P и программное обеспечение для разделенного экрана, можно одновременно наблюдать за двумя мечеными белками in vivo.
На этой серии таймлапс-изображений представлено множество аксональных везикул на многочисленных аксональных путях внутри сегментарного нерва личинки. Обратите внимание на GFP, представляющий аксональные скопления, а также на двунаправленное движение везикул. Здесь показано движение аксональных везикул по одному пути внутри сегментарного нерва личинки.
Обратите внимание, что двунаправленное движение этих структур составляет в среднем один микрон в секунду. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выполнить чистую диссекцию для визуализации везикул, меченных GFP, и аксонов личинок gsof in vivo.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод вивисекции личинок Drosophila для визуализации перемещения аксональных везикул, меченных GFP, по микротрубочкам. Этот метод позволяет визуализировать живое, беспрепятственное движение синаптических везикул внутри аксонов личинок.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Методы визуализации
Введение
- Аксональный транспорт имеет решающее значение для функционирования нейронов.
- Нарушения аксонального транспорта связаны с неврологическими заболеваниями.
- Личинки Drosophila служат модельным организмом для изучения этих процессов.
- Флуоресцентная микроскопия позволяет наблюдать перемещение везикул в режиме реального времени.
Цель исследования
- Исследовать дефекты аксонального транспорта на большие расстояния.
- Понять значение этих дефектов при неврологических заболеваниях.
- Использовать методы визуализации живых объектов для улучшения качества наблюдений.
Используемые методы
- Диссекция личинок Drosophila, экспрессирующих белки с GFP-меткой.
- Перенос диссекированных личинок в гелевый куб для стабилизации.
- Визуализация in vivo с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Отслеживание транспорта везикул внутри аксонов.
Основные результаты
- Успешная визуализация аксонального транспорта в живых личинках.
- Демонстрация перемещения везикул, меченных GFP.
- Представление о динамике транспорта синаптических везикул.
- Сравнение с существующими методами подчеркивает преимущества данного подхода.
Выводы
- Данный протокол представляет собой ценный инструмент для изучения аксонального транспорта.
- Визуализация живых клеток позволяет получить важные сведения о функционировании нейронов.
- Этот метод может быть применен для исследования различных неврологических заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Понимание динамики аксонального транспорта имеет решающее значение для снижения рисков при выборе мишеней для терапии нейродегенеративных заболеваний, поскольку дефекты везикулярного трафика механистически связаны с болезнями Альцгеймера, Гентингтона и БАС. Данная модель аксона личинки Drosophila позволяет визуализировать перемещение синаптических везикул в режиме реального времени, предоставляя прогностическую, релевантную заболеванию систему для ранней валидации мишеней и получения данных о механизмах патологии. Путем количественной оценки двунаправленного потока везикул и скорости транспорта данный метод позволяет принимать решения о целесообразности продолжения (go/no-go) доклинических программ, направленных на сохранение целостности аксонов.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации транспорта везикул с APP или синаптотагмином, меченными GFP, в живых аксонах.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством прямого наблюдения за динамикой везикул в генетически модифицируемой системе.
- Прогностическая ценность: Способствует снижению механистических рисков за счет установления связи между дефектами транспорта и нейрональной дисфункцией в моделях заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных аксональных систем для скрининга соединений путем установления базовой подвижности везикул в физиологических условиях.
- Практическая ценность: Получение количественных, воспроизводимых показателей перемещения везикул (например, двунаправленный поток 1 µm/s) для стандартизации анализа.
- Стратегическая ценность: Обеспечение масштабируемых, совместимых с платформой рабочих процессов визуализации для оценки влияния соединений на аксональный транспорт.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, имеющим отношение к заболеваниям, путем моделирования дефектов транспорта, наблюдаемых при нейродегенеративных состояниях у человека.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации посредством визуализации транспорта везикул в режиме реального времени в интактных нервах личинок.
- Минимизация рисков: Обосновывает решения о дальнейшем продвижении за счет количественной оценки восстановления или ухудшения транспорта под воздействием потенциальных модуляторов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез на ранних стадиях поиска, готовность анализов для скрининга и механистическую валидацию на доклинических этапах.
- Поисковая биология: способствует уточнению путей передачи сигналов и снижению биологических рисков за счет визуализации везикулярного транспорта в ответ на генетические или фармакологические воздействия.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа с помощью стандартизированных протоколов диссекции, окрашивания и визуализации, которые позволяют получать стабильные показатели подвижности везикул.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зависимых переменных (скорость, направленность, поток), что позволяет проводить сравнение между различными экспериментальными условиями.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом путем моделирования дефектов аксонального транспорта, имеющих значение для неврологических заболеваний человека.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую платформу визуализации для лонгитюдных исследований целостности аксонов для нескольких классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности при валидации мишеней за счет прямой визуализации динамики синаптических везикул.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря определенным условиям буфера для диссекции и параметров визуализации.
- Стратегическая ценность: Улучшение принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет снижения механистической неопределенности в гипотезах аксонального транспорта.
- Влияние на портфель: Приоритизация мишеней с учетом рисков на основе эффективности восстановления транспорта в моделях, релевантных соответствующему заболеванию.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Drosophila, проведения микродиссекции и флуоресцентной микроскопии.
- Необходим инвертированный микроскоп с 100-кратным объективом, системой двойного обзора и соответствующими наборами фильтров для GFP и других флуорофоров.
- Требуется стандартизация буфера для диссекции, стадирования личинок и условий окружающей среды (влажная камера, температура).
- При адаптации метода следует учитывать экспрессию различных GFP-меченых объектов (например, митохондрий, лизосом) с помощью нейрональных драйверов GAL4.
- Практические ограничения включают время подготовки личинок и временное окно в 2–3 часа после диссекции для обеспечения активного транспорта везикул.
