Введение. stephensi Эмбрионы для генерации устойчивых к малярии комаров

Каждые 15 секунд в мире от малярии умирает ребенок; здесь, в лаборатории Джеймса, мы пытаемся создать французских комаров, которые не могут переносить возбудителей малярии. Меня зовут TIUs. Я нахожусь в Калифорнийском университете в Ирвайне на кафедре молекулярной биологии и биохимии в лаборатории Энтони Джеймса.

Сегодня я покажу вам, как создавать трансгенных и нет-Стивенс глаз. Мы делаем это, чтобы сделать комаров-переносчиков малярии рефрактерными, чтобы они не могли переносить малярийного паразита. Сейчас я подготовил флакон с изотоническим буфером, в который комары будут откладывать яйца.

Я воспользуюсь этим аспиратором, чтобы собрать комаров и поместить их в пробирку. Затем эта пробирка будет помещена в инкубатор при температуре 30 °C, где она останется примерно на один час в стаканчике. Теперь мы достанем иглы для микроинъекций.

Это иглы из кварца, и нам необходимо использовать очень тонкий кончик. Поэтому нам требуется вытягиватель игл. Мы используем вытягиватель игл от Suter Instruments, а также иглы от Suter Instruments.

Теперь я извлекаю комаров и помещаю яйца в чашку Петри на фильтровальную бумагу, смоченную изотоническим буфером, чтобы эмбрионы оставались влажными в течение всего периода инъекций. Количество воды на фильтровальной бумаге имеет решающее значение: яйца не должны плавать, но и бумага не должна пересыхать.

Теперь я перенесу эмбрион с фильтровальной бумаги для яиц на другой лист бумаги Whatman с диаметром 3 мм, предварительно замоченный в изотоническом буфере. Это необходимо для удаления хориона перед выравниванием эмбрионов для микроинъекции. Сейчас я удалю хорион, который представляет собой серебристую поверхность яиц.

Для этого я смахиваю их кистью. Здесь сверху у нас эмбрион, на котором все еще находится хорион, и у него есть эта серебристая блестящая часть. А где тот, что ниже?

Мне удалось извлечь Corian; верхняя часть, вероятно, будет скользить по ленте, в то время как нижняя будет прилегать плотно. Это имеет решающее значение при создании несимметричного края. Теперь я выравниваю эмбрионы.

Эмбрионы более массивны на переднем конце, и его я располагаю справа. Слева находится задний конец, который более узкий и в который я буду вводить инъекции. Я стараюсь разместить их вместе, чтобы они поддерживали друг друга и оставались в нужном положении.

Обычно я выстраиваю по 10 эмбрионов в один ряд. Теперь, когда у меня есть такой ряд эмбрионов, я перенесу их на покровное стекло. На покровное стекло.

Я наклеиваю ленту для париков, чтобы обеспечить фиксацию. После этого я просушиваю фильтровальную бумагу с эмбрионами с помощью другой фильтровальной бумаги, переношу эмбрионы на покровное стекло и даю им высохнуть в течение 30 секунд перед нанесением масла. Теперь эмбрионы выровнены и находятся под слоем масла.

На предметном столике микроскопа мы введем ДНК, смешанную с пищевым красителем, используя этот специальный наконечник для микроинъекций, и загрузим смесь в иглу порта. Теперь, когда игла заполнена, мы установим ее обратно в микроинжектор. Теперь мы готовы приступить к проведению микроинъекций.

Теперь я перемещаю иглу, чтобы настроить резкость и добиться четкого фокуса. После этого я перемещаю контрольную иглу, затем перехожу к эмбрионам и также фокусируюся на них. Когда это сделано, я снова перемещаю иглу, пока она не окажется в нужном положении, и подвожу её к эмбрионам.

Теперь, когда игла проходит сквозь масло, изображение становится размытым, и его нужно снова настраивать. Вот так это и работает. Именно так, щелчок.

Теперь я готов приступить к инъекциям. Обратите внимание, что я коснулся эмбриона иглой, тем самым разбив кончик; теперь видна маленькая капля, которая будет введена в эмбрион. Таким образом, я выполняю инъекцию и снова извлекаю иглу.

Я каждый раз между эмбрионами проверяю, чтобы на кончике иглы появлялась маленькая капля. Как видите, мне нужно заново корректировать положение для каждого эмбриона, чтобы достичь идеального позиционирования. В данном случае произошла утечка.

Как видите, при выполнении второй инъекции в масле пузырек становится очень большим, и мне необходимо заново отрегулировать давление микроинъектора. Теперь, когда микроинъекции завершены, мы перенесем эмбрионы из-под микроскопа в чашку Петри, заполненную изотоническим буфером. Я удалю масло с покровного стекла и отрежу от него небольшой фрагмент, который помещу в чашку Петри.

Теперь мы оставим их здесь до конца дня при комнатной температуре. После этого мы переместим их в инсектарий. Сегодня я показал вам, как проводить инъекции в сторону гемоцеля для создания транзиентных комаров.

Теперь нам остается только дождаться вылупления всех личинок. Мы вырастим их до стадии взрослых особей, после чего они спариваются. Затем пройдет три недели, прежде чем мы сможем начать скрининг на предмет того, являются ли они Refactor или нет.