Transnuclear Мыши с Предустановленные Т Особенности клеточного рецептора Против Toxoplasma гондий, Полученные через SCNT
30 сентября 2010 г.
Мы показываем здесь, что эпигенетические перепрограммирования через пересадки ядра соматической клетки (SCNT) может быть использован как инструмент для создания моделей мышей с заранее определенными рецепторами Т-клеток (TCR) особенностей. Эти transnuclear мышей выразить соответствующее TCR от их национального локуса под контролем эндогенных промоутера.
Трансгенные мыши с антигенспецифическими Т-клеточными рецепторами незаменимы при изучении развития и функций Т-клеток, а также при создании мышиных моделей с предопределенной специфичностью Т-клеточных рецепторов с помощью переноса ядер соматических клеток или SCNT. Мышь заражают интересующим патогеном. Т-клетки выделяют из организма мыши, после чего их очищают методом сортировки клеток с помощью флуоресцентно-активированного цитометра.
Очищенные Т-клетки затем используют для переноса ядер соматических клеток. После того как эмбрионы достигают стадии бластоцисты, изолируют эмбриональные стволовые клетки. Затем эти клетки вводят в бластоцисты, которые затем переносят псевдобеременным мышам.
Полученные щенки демонстрируют выраженное увеличение интересующей популяции Т-клеток, что может быть подтверждено анализом PAX. Здравствуйте, меня зовут Okta AK, я постдок в Институте биомедицинских исследований White. Сегодня я покажу вам, как проводить инъекции для бласт-ассистированного переноса соматических CLE, а также перенос эмбрионов.
Основным преимуществом соматического переноса является возможность быстрого создания мышиных моделей, экспрессирующих T-клеточный рецептор из эндогенного локуса и, следовательно, под контролем эндогенного промотора. Соматический перенос может быть использован как инструмент для создания мышиных моделей с заданными специфичностями T-клеточных или B-клеточных рецепторов. Это представляет особый интерес для исследователей, работающих в таких областях, как аутоиммунитет, инфекционные заболевания и онкология.
Для изоляции Т-клеток, специфичных к такому патогену, как Toxoplasma gondii, мыши, инфицированные путем внутрибрюшинного введения в пике иммунного ответа, подвергают эвтаназии, после чего извлекают селезенку. Клетки донора гомогенизируют, затем изолируют и инкубируют с флуоресцентно мечеными антителами и соответствующим тетрамером. В завершение проводят сортировку клеток для получения Т-клеток, специфичных к патогену. Накануне вечером перед процедурой энуклеации ооцитов.
Подготовьте инъекционные иглы piso диаметром четыре, пять и семь микрометров, используя шприц для их ретроградного заполнения ртутью. На следующий день начните протокол переноса ядер соматических клеток со сбора ооцитов, затем с помощью ротовой пипетки перенесите их в капли среды K-S-O-M-A-A в чашку Петри. В крышке чашки Петри.
Подготовьте планшет для проведения переноса ядер соматических клеток или SCNT, нанеся в него примерно 10 капель PVP, примерно 10 капель HCZB, содержащего 5 µg/mL cyto B, и примерно 10 капель HCCB, содержащего 2.5 µg/mL cyto B. Этот планшет будет именоваться планшетом S-C-N-T-A. Поместите планшет S-C-N-T-A на предметный столик инвертированного сложного микроскопа.
Затем установите иглу для энуклеации диаметром 7 мкм в микроманипулятор и промойте ее, 5–10 раз втягивая и вытесняя раствор PVP в зону сброса. Затем перенесите от 10 до 30 ооцитов, заблокированных в метафазе II, из чашки Петри в одну из капель HCCB с содержанием Cyto B 5 мкг/мл на планшете S-C-N-T-A. Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре; во время инкубации выровняйте ооциты горизонтально.
По истечении пяти минут с помощью иголки для энуклеации поместите ооцит перед удерживающей иглой. Используя микроинжектор, создайте вакуум, чтобы зафиксировать ооцит в микропипетке удерживающей иглы.
Затем, используя иглу для энуклеации, поверните ооцит так, чтобы комплекс веретена деления хромосом, который выглядит более прозрачным по сравнению с цитоплазмой, находился в положении «на три часа», и инициируйте пьезоимпульс, нажав на педаль, чтобы проникнуть сквозь zona lucida. Пьезоимпульс представляет собой механический импульс, который распространяется продольно и вызывает вибрацию кончика иглы для энуклеации. Вибрации кончика облегчают прохождение сквозь zona lucida.
Проколов zona pellucida, поместите отверстие иглы для нуклеации рядом с веретеном деления метафазы II и создайте вакуум. Хромосомно-веретенный комплекс медленно переместится в иглу. После извлечения иглы мембрана должна самостоятельно закрыться.
Наконец, с помощью ротовой пипетки перенесите энуклеированные циты обратно в капли K-S-O-M-A-A. Затем, используя ту же пипетку, промойте их, перенося из одной капли KSOM AA в другую. Для проведения переноса ядра замените иглу для энуклеации размером 7 мкм на микроманипуляторе на иглу для переноса ядра размером 4–5 мкм. Промойте иглу с PVP, как было описано ранее.
Поместите восемь положительных T-клеток CD, выделенных ранее, в каплю PVP на планшет S-C-N-D-A. Тщательно перемешайте и инкубируйте не менее 10 минут при комнатной температуре. Затем перенесите от 10 до 30 ЭНУКЛЕИРОВАННЫХ цитов в каплю HCZB с концентрацией 2.5 µg/mL.
Инкубируйте планшет с Cyto B на S ct в течение пяти минут при комнатной температуре. Во время инкубации используйте иглу для переноса ядер, чтобы выровнять циты горизонтально с помощью инъекционной иглы.
Заберите донорскую клетку, положительную по CD8, из среды PVP и совершите несколько движений всасывания и выталкивания до тех пор, пока внешняя мембрана не разрушится. При необходимости примените пьезо-импульс; должны стать видны фрагменты мембраны и цитозоля. Втяните ядро в иглу.
Затем продолжайте собирать ядра, пока их количество не составит от 10 до 30. Далее перейдите к капле, содержащей выровненные энуклеированные ооциты. Включите вакуум, чтобы зафиксировать один ооцит на удерживающей игле.
Затем расположите иглу для переноса ядер NU рядом с zop lucita так, чтобы ядра были ориентированы в сторону от отверстия. Подавайте пьезоимпульсы до тех пор, пока игла не пройдет сквозь zop lucita. С помощью микроманипулятора осторожно переместите одно ядро к кончику иглы.
Введите иглу в ооцит до тех пор, пока ее кончик не окажется внутри на две трети. Создайте небольшое отрицательное давление, чтобы часть мембраны ооцита затянулась в иглу. Следующий шаг является критически важным.
Поскольку это единственный момент, когда ооцит фактически открыт, подайте один импульс ZO. Затем приложите положительное давление, чтобы вытолкнуть ядро из иглы.
Осторожно вытяните иглу так, чтобы её кончик находился примерно на одной трети глубины в ооците, затем создайте отрицательное давление и продолжайте вытягивать иглу. Это позволит герметизировать ооцит. Повторите этот шаг для каждого ооцита.
После того как все ооциты получат ядро, перенесите их в чашку Петри и промойте, перемещая их из капли в каплю среды KS OM AA, инкубированной при 37 °C в течение не менее 30 минут. После инкубации перенесите эмбрионы SCN T в капли безкальциевой среды для активации, содержащей хлорид стронция. Хлорид стронция активирует ооцит, индуцируя осцилляции кальция, которые аналогично происходят при оплодотворении.
Инкубируйте в течение шести часов. При необходимости добавьте в среду для активации TSA, который является неспецифическим ингибитором гистондеацетилаз. Чтобы повысить эффективность после активации, исследуйте эмбрионы под инвертированным микроскопом для определения количества псевдопронуклеусов или PPN-положительных эмбрионов SCNT. PPN можно идентифицировать по их внешнему виду.
Они выглядят как яйца. Промойте и культивируйте их желтком вверх. Эмбрионы содержат в каплях K-S-O-M-A-A в течение трех с половиной дней при 37 °C до достижения стадии бластоцисты.
Для начала следует сосредоточиться на правильном выполнении только что продемонстрированных процедур по нуклеации и ядерному переносу (NU). После освоения этих методов выполнение последующих этапов станет проще. Эмбриональные стволовые клетки (ES-клетки), использованные в данной работе, были получены с помощью стандартных методов.
Их следует подготовить в день проведения инъекции с помощью бласт-ассистирования, через три с половиной дня после спаривания. Подготовьте крышку стерильного чашки Петри, нанеся капли, содержащие PVP и HCZP. Затем подготовьте инъекционную иглу диаметром 15 мкм для импульса piso, как было описано ранее.
Затем установите инъекционную иглу в микроманипулятор и промойте ее с помощью PVP-переноса. Выполните от 10 до 30 импульсных воздействий в каплю HCZB. Затем поместите от 5 до 50 µL суспензии ESL в другую каплю HCZB.
Количество ЭСК должно быть достаточным для того, чтобы их можно было легко захватить, но при этом клетки не должны быть расположены слишком плотно. Затем с помощью инъекционной иглы захватите от 30 до 100 ЭСК. Переместите иглу в каплю с вспомогательным бластомером.
Выровняйте бластоцисту по горизонтали и зафиксируйте ее с помощью удерживающей иглы, подав вакуум. С помощью инъекционной иглы поверните бластоцисту так, чтобы внутренняя клеточная масса оказалась на положении «девять часов». Установите инъекционную иглу на положении «три часа».
Убедитесь, что на кончике иглы нет ЭСК, и подавайте пизо-импульсы до тех пор, пока инъекционная игла не пройдет сквозь zona pellucida и трофэктодерму в бластоцель. Выпустите от 5 до 15 ЭСК так, чтобы они прикрепились к внутренней клеточной массе. Продолжайте процедуру, пока все бластоцисты не будут инъецированы. После завершения инъекций прекратите подачу импульсов.
Промойте дважды в среде K-S-O-M-A-A, после чего приступайте к хирургическому переносу эмбрионов в псевдобеременных самок. Поместите анестезированную мышь-реципиент (псевдобеременную самку) в зону проведения операции. С помощью электрического бритвенного станка удалите шерсть из нижнего правого квадранта. Продезинфицируйте эту область раствором на основе йода и 70% ethanol под диссекционным микроскопом.
С помощью ножниц сделайте разрез кожи, затем введите закрытые ножницы между кожей и брюшиной и раскройте их, чтобы отделить брюшину от кожи. Найдите яичник через брюшину; он должен выглядеть как красное пятно. После этого с помощью ножниц вскройте брюшину в этой области.
С помощью пинцета осторожно захватите UCT или окружающую жировую ткань и извлеките матку, используя капилляр, подключенный к ротовому пипетору. Захватите группу из примерно 10 бластоцист, удерживая яйцевод и матку пинцетом. С помощью иглы сделайте небольшое отверстие в матке.
Затем введите капилляр с бластоцистой в просвет матки и отпустите их. Верните матку в брюшную полость. Найдите края брюшины и зашейте их несколькими стежками.
Закройте кожу мыши несколькими степлерами. Введите подкожно обезболивающий препарат. Затем перенесите мышь обратно в клетку под нагревательную лампу.
Следите за дыханием мыши до ее пробуждения. После энуклеации и переноса ядер соматических клеток примерно у 70% эмбрионов были обнаружены псевдопронуклеусы.
Как показано на этом рисунке. Обработка TSA в течение 6 или 10 часов не оказала влияния. После трех с половиной суток культивирования от 5 до 10% эмбрионов развились до стадии бластоцисты.
Опять же, добавление TSA не повлияло на скорость развития бластоцист. Затем полученные путем SCNT бластоцисты были использованы для выведения эмбриональных стволовых клеток. TSA значительно повысило эффективность выведения ESC из бластоцист.
Клетки S-C-N-T-E-S используются для создания химерных мышей. У этих мышей берут кровь и анализируют ее на наличие специфических Т-клеток с помощью FACS-анализа, как показано здесь. При окрашивании крови антителами к CD4 и специфическим тетрамером можно идентифицировать дважды положительную популяцию.
Это указывает на то, что донорская клетка, использованная для SCNT, обладала правильной специфичностью. Я только что продемонстрировал вам, как выполнять перенос ядер соматических клеток, инъекции с помощью бластоцист и перенос эмбрионов. Самым важным моментом, который следует учитывать, является чистота ваших Т-клеток или В-клеток.
После того как вы освоили метод соматического переноса и ваши эмбрионы достигли стадии бластоцисты, вы можете выбрать либо их прямой перенос псевдобеременным самкам, либо использование их для получения эмбриональных стволовых клеток и создания химерных мышей.
Обзор
В данном исследовании демонстрируется использование метода переноса ядер соматических клеток (SCNT) для создания мышиных моделей с предопределенной специфичностью Т-клеточных рецепторов (TCR). Трансгенные мыши экспрессируют TCR из своего эндогенного локуса под контролем эндогенного промотора.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Генетика
Теоретические основы
- Трансгенные мыши имеют решающее значение для изучения развития и функций Т-клеток.
- SCNT позволяет быстро создавать модели мышей.
- Эндогенный контроль экспрессии TCR полезен для исследований.
- Для создания моделей можно выделять Т-клетки, специфичные к определенному патогену.
Цель исследования
- Изучить применимость SCNT для создания мышиных моделей со специфическими TCR.
- Углубить понимание Т-клеточных ответов при различных заболеваниях.
- Предложить методику для быстрого создания моделей.
Используемые методы
- Выделение Т-клеток из инфицированных мышей.
- Флуоресцентная сортировка клеток (FACS) для очистки.
- Протокол SCNT для переноса ядер в ооциты.
- Валидация популяций Т-клеток с помощью PAX-анализа.
Основные результаты
- Успешное получение трансгенных мышей, экспрессирующих специфические TCR.
- Увеличение популяций Т-клеток у полученных потомков.
- Продемонстрированная эффективность SCNT при создании модельных животных.
- Подтвержденная специфичность Т-клеток посредством экспериментального анализа.
Выводы
- SCNT является эффективным методом создания таргетных моделей мышей.
- Такие модели могут быть использованы для изучения аутоиммунитета, инфекционных заболеваний и рака.
- Эндогенная экспрессия TCR повышает релевантность исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Создание мышиных моделей с предопределенной специфичностью Т-клеточных рецепторов с помощью переноса ядер соматических клеток позволяет добиться быстрого эндогенного экспрессии антиген-специфических TCR без использования искусственных промоторов или случайной интеграции. Такой подход снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней, сохраняя физиологическую кинетику и уровни экспрессии TCR. Данный метод повышает точность прогнозов на ранних этапах поиска, предоставляя релевантные для конкретных заболеваний системы для снижения механистических рисков в исследованиях в области иммунологии, инфекционных заболеваний и онкологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, используя Т-клетки с физиологически экспрессируемыми патоген-специфическими TCR из эндогенных локусов.
- Практическая ценность: Обеспечивает быстрый способ создания трансгенных моделей без длительного культивирования или смещения селекции, вызванного воздействием антигена.
- Научная ценность: Способствует биологическому снижению рисков за счет сохранения естественной кинетики сигналинга TCR и исключения артефактов, связанных с гиперэкспрессией.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание валидированных биологических систем с определенной специфичностью TCR для стандартизированных анализов иммунных клеток.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимой подготовки популяций Т-клеток для последующих рабочих процессов скрининга с помощью изоляции методом FACS и SCNT.
- Научная ценность: Поддержка стандартизации анализа путем обеспечения постоянного ввода антигенспецифических Т-клеток на основе эндогенной экспрессии TCR.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует согласованию трансляционных биомаркеров путем моделирования Т-клеточных ответов человека на такие патогены, как Toxoplasma gondii.
- Практическая ценность: обеспечивает непрерывность процесса от стадии поиска до доклинической валидации с использованием экспрессии эндогенных TCR у химерных мышей.
- Научная ценность: поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков, обеспечивая функциональную валидацию специфичности TCR с помощью PAX и тетрамерного анализа.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Модель Т-клеточного рецептора, полученная методом SCNT, интегрируется в континуум разработки — от валидации мишени до доклинических исследований, обеспечивая снижение механистических рисков и прогностическую уверенность в эффективности терапии, направленной на иммунную систему.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей с использованием T-клеток с заранее определенной специфичностью к инфекционным агентам.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа и получение количественных данных с помощью T-клеток, специфичных к патогенам и очищенных методом FACS, которые используются в SCNT.
- Аналитика: Предоставляет измеримые результаты с помощью анализа PAX и окрашивания тетрамерами для подтверждения специфичности TCR и отслеживания иммунных ответов.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность доклинических исследований с использованием химерных мышей, экспрессирующих эндогенные TCR, для мониторинга иммунного ответа при соответствующих заболеваниях.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для генерации моделей с определенным TCR для портфелей исследований аутоиммунных заболеваний, рака и инфекционных болезней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет физиологической экспрессии TCR и снижение механистической неопределенности при иммунном таргетировании.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря экспрессии в эндогенном локусе и рабочим процессам изоляции на основе FACS.
- Стратегическая ценность: Принятие более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки за счет снижения биологических рисков на поздних стадиях создания иммунотерапии и вакцин.
- Влияние на портфель: Приоритизация мишеней с учетом рисков с использованием валидированных, релевантных заболеванию моделей Т-клеток с определенной специфичностью.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области переноса ядер соматических клеток, культивирования эмбриональных стволовых клеток и методов иммунологической валидации.
- Зависит от наличия систем микроманипуляции, оборудования для работы с ооцитами и инфраструктуры для инъекций в бластоцисты.
- Необходимо согласование стандартов между группами иммунологии, биологии развития и центрами по созданию трансгенных моделей.
- При адаптации следует учитывать применимость модели к различным линиям мышей и эффективность изоляции Т-клеток, специфичных для конкретных патогенов.
- Практические ограничения включают скорость формирования бластоцист и эффективность получения эмбриональных стволовых клеток после SCNT, как указано в протоколе.
