Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

G-белок-зависимые входящие ректифицирующие калиевые каналы или GIRK играют важную роль в регуляции возбудимости нейронов. Каналы GIRK могут быть активированы как рецепторами, сопряженными с G-белком (GPCRs), такими как мускариновый рецептор M2R, так и алкоголем. Для изучения влияния мутаций в сайте связывания алкоголя в GIRK с помощью сайт-направленного мутагенеза в кДНК GIRK вносится одна точечная мутация; очищенные конструкции GIRK совместно с конструкциями YFP трансфицируют в клетки млекопитающих, после чего эффективность трансфекции оценивают с помощью флуоресцентной визуализации.

Затем проводится анализ методом патч-клампа в конфигурации «целая клетка» для сравнения активации, зависящей от алкоголя и G-белков. Эта визуальная демонстрация эксперимента предоставит вам ключевую информацию о том, как изучать функцию каналов LY. Сегодня мы рассмотрим вопрос о том, каким образом алкоголь активирует каналы данной группы.

Описанный здесь метод направленного неогенеза позволяет изучить функции ионных каналов. Данный метод также может быть применен к другим системам, в которых известно, что мутация в гене вызывает заболевание у человека. Это демонстрация техники патч-клампа на горячих клетках; она является критически важной, так как многие этапы требуют точности, правильной электронной компенсации и практики для получения достоверных данных.

ДНК, используемая для трансфекции в данном протоколе, подготавливается следующим образом. Сначала субъединица GRK, ДНК, полученная методом ПЦР, клонируется непосредственно в экспрессионный вектор для млекопитающих. В плазмиду pcDNA 3.1 вводятся точковые мутации с использованием специально разработанных праймеров и набора для сайт-направленного мутагенеза QuickChange XL II.

С помощью этой системы проводится ПЦР, в ходе которой реплицируется вся плазмида и вводятся точечные мутации, закодированные праймерами. После ПЦР реплицированные плазмиды обрабатывают рестрикционным ферментом Dpn I, а затем трансформируют методом теплового шока в ультракомпетентные клетки E. coli штамма XL 10-Gold. Трансформированные бактерии выращивают на чашках с LB-агаром, содержащим ампициллин; бактерии, несущие плазмиду, устойчивы к ампициллину и образуют колонии.

Изолированные колонии отбирают и выращивают в мини-культурах. Для выделения плазмидной ДНК проводят мини-препарацию. Затем ДНК секвенируют, чтобы определить успешно трансформированные мутанты.

E coli выращивают в большом объеме, после чего проводят макси-препарацию для получения большего количества плазмидной ДНК. В каждую из двух лунок 12-луночного планшета высевают примерно 1 × 10⁵ клеток HEK 293T: одну для мутанта, другую — для контроля (канал дикого типа). Инкубируют при 37 °C.

Через 8–24 часа клетки прикрепятся к подложке и будут готовы к трансфекции. Проведите трансфекцию клеток с помощью Lipo 2000 согласно инструкциям производителя, используя 0,2 мкг кДНК канала, 0,4 мкг кДНК рецептора M2R и 0,04 мкг кДНК YFP. Для идентификации успешно трансфицированных клеток инкубируйте их в течение 24 часов.

По истечении необходимого времени инкубации поместите клетки на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа для определения эффективности трансфекции. Сравните флуоресцентные изображения и изображения, полученные методом дифференциально-интерференционного контраста (DIC), чтобы определить процент трансфицированных клеток. Верните чашку с культурой обратно в инкубатор.

Очистите стеклянные покровные стекла диаметром 12 миллиметров и храните их в этаноле до использования. Удалите остатки этанола путем обжигания в стерильном боксе. Поместите покровные стекла в 24-луночный планшет и покройте их слоем 0.2 milligrams per milliliter.

Через 24 часа после трансфекции обработайте клетки трипсином и высейте их в плотности 4 × 10³ клеток на лунку на подложку с поли-D-лизином. В 4–8 лунках 24-луночного планшета с покровными стеклами, покрытыми поли-D-лизином, инкубируйте клетки еще 24–48 часов перед проведением патч-кламп записи всего препарата (whole-cell patch clamping). Изготовьте патч-электроды с помощью двухступенчатого вертикального пуллера и боросиликатного стекла для электродов.

В идеале готовый электрод должен иметь сопротивление от трех до семи мегаом и не требовать дополнительной обработки, такой как тепловая полировка. Для проведения патч-клампа поместите покровное стекло с трансфецированными клетками в чашку диаметром 35 мм, содержащую внешний раствор с 20 мМ калия или 20 K. Поместите чашку на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа.

В используемой здесь установке для патч-кламппинга применяется система перфузии. Эта система содержит внеклеточные растворы, которые подаются к клеткам самотеком по трубкам, подключенным к коллектору. Подача каждого раствора регулируется дистанционно с помощью электромагнитного зажимного клапана.

Используйте дифференциально-интерференционный контраст (DIC) для фокусировки и поиска клеток. Переключитесь на фильтр YFP, чтобы определить YFP-положительные клетки. После идентификации YFP-положительных клеток расположите кончик системы перфузии на расстоянии 20–30 мкм или двух-трех диаметров клетки от целевой клетки.

Заполните электрод внутренним раствором для электрода. Используя шприц и гибкую иглу, осторожно постучите по заполненному электроду, чтобы удалить пузырьки воздуха из кончика. Подключите электроды к головному блоку усилителя AXO patch 200 B.

Снова проверьте, чтобы настройки усилителя соответствовали одной конфигурации. Переключатель «whole cell» установлен в положение beta = 1, а фильтр нижних частот сосуда настроен на 10 kHz. Создайте положительное давление с помощью шприца и зажима, чтобы поддерживать чистоту кончика электрода.

Затем с помощью микроманипулятора опустите кончик электрода в ванночку и переместите его над клеткой. Переключите усилитель в режим V track, а ручку измерителя — в положение V track. Затем с помощью регулятора смещения потенциала пипетки на усилителе обнулите потенциал пипетки, доведя значение напряжения на дисплее измерителя усилителя до 0.00.

В качестве альтернативы переключите усилитель в режим V-clamp и нажмите кнопку тестового импульса для подачи тестового скачка напряжения. Прямоугольный скачок напряжения отобразится в окне проверки герметичности (seal test) программы clamp. Отрегулируйте смещение пипетки на усилителе, чтобы привести базовый ток к нулевому значению nA.

Тест на герметичность покажет сопротивление электрода, которое должно составлять от трех до семи МОм. Затем закройте окно теста на герметичность. В выпадающем меню выберите «acquire open protocol».

Затем выберите сохраненный протокол подачи напряжения. В данном случае выбран протокол, предварительно запрограммированный на подачу одного скачка напряжения до -100 millivolts с последующим линейным увеличением до +40 millivolts каждые две секунды. Такой протокол с постепенным увеличением напряжения позволяет наблюдать потенциал реверсии и свойство внутреннего выпрямления GK-каналов.

Для потенциал-зависимых ионных каналов может быть более подходящим использование прямоугольного скачка напряжения. С помощью точной настройки микроманипулятора приблизьте электрод к клетке, сбросьте положительное давление, а после касания поверхности клетки приложите небольшое отрицательное давление. Следите за соответствующим увеличением сопротивления в тесте на герметичность (seal test). Когда сопротивление достигнет диапазона гигаом, это будет означать, что электрод плотно прилегает к мембране (образовался гигаомный контакт).

Это называется гигаомным уплотнением (giga seal). С помощью шприца приложите импульс отрицательного давления, чтобы прорвать мембрану и получить доступ к содержимому клетки. При переходе в конфигурацию «целая клетка» (whole cell) при проверке уплотнения будут регистрироваться большие емкостные токи, которые проявляются в виде всплесков или переходных процессов в начале и в конце теста.

Проверка герметичности с помощью импульса. Затем нажмите кнопку проверки мембраны. В зажиме X зарегистрируйте сопротивление доступа и сопротивление мембраны.

Емкость мембраны в блокноте позволяет визуально проверить экспоненциальное соответствие. Емкость мембраны пропорциональна размеру клетки и будет использована для расчета плотности тока. Сопротивление доступа и сопротивление мембраны используются для оценки того, будет ли запись удовлетворительной для продолжения работы.

Хорошая запись будет характеризоваться низким сопротивлением доступа. Теперь закройте окно тестирования мембраны и снова нажмите кнопку тестирования герметичности; в окне тестирования герметичности установите V out на -40 mV для компенсации емкости мембраны и последовательного сопротивления на усилителе, включите компенсацию емкости всей клетки (whole cell cap), регулируйте компенсацию емкости всей клетки и последовательное сопротивление до тех пор, пока переходный процесс не будет минимизирован, а ток не станет представлять собой прямую линию. При необходимости отрегулируйте емкость пипетки с помощью ручки fast cap на усилителе.

Слишком большая или слишком малая компенсация приведет к появлению переходного процесса остаточной емкости. Затем поверните ручку прогнозирования процента (percentage prediction) до 60–80%, при необходимости повторно настройте емкость всего This cell (whole cell cap), последовательное сопротивление (series resistance) и быструю емкость (fast cap), чтобы получить горизонтальную линию при проверке герметичности (seal test). Наконец, установите компенсацию процентов (percentage comp) примерно на 100% без возникновения осцилляций в клетке, стараясь поддерживать максимально линейный импульс путем повторной регулировки потенциометров емкости всего This cell (whole cell cap), последовательного сопротивления (series resistance) и быстрой емкости (fast cap).

После достижения компенсации сопротивления и емкости запишите в блокнот значения, установленные для процента последовательного сопротивления емкости усилителя, процента компенсации, прогнозируемого значения и времени задержки, затем откройте клапан подачи внешнего раствора для контрольного термостата с температурой 20 K. Установите фильтр низких частот сосуда на усилителе на 2 kHz. После этого начните запись токов, нажав кнопку записи в программном обеспечении.

Проверьте наличие свойства входящего выпрямления тока GER. Оно проявляется как большой входящий ток при значениях потенциала, отрицательных относительно потенциала реверсии калия, который определяется уравнением Нернста EK, и малый выходящий ток при значениях, положительных относительно EK. После записи стабильной базовой линии определите рецепторную активацию токов, применив внеклеточный раствор с 20 k плюс карбахолом.

После того как будет зафиксирована максимальная активация и ток достигнет стационарного состояния, вернитесь к раствору K-ванны и подождите достижения исходного уровня тока. Далее, для изучения активации токов gert алкоголем, переключитесь на внешний раствор с 20 k плюс 100 millimolar этанола и дождитесь пикового ответа.

Затем снова переключитесь на раствор для ванны 20 K и дождитесь достижения базового уровня тока. Наконец, для определения базальных токов gert переключитесь на раствор 20 K с добавлением 20 K бария и дождитесь соответствующего ответа. Ингибирование тока gerk должно быть очевидным, при этом наиболее выраженным оно будет при минус 100 millivolts на протяжении всей процедуры.

Отметьте номер записи (sweep number), соответствующий применению различных внеклеточных растворов. Один файл clamp fit будет содержать все записи за весь период экспериментов. Для анализа данных GK используйте программное обеспечение clamp FIT 8.2.

Согласно инструкциям, приведенным в прилагаемом письменном протоколе, были получены две разные записи целого тока от клеток HEC 2 9 3 T, экспрессирующих либо каналы GK дикого типа, либо мутантные каналы GK, которые анализировались в соответствии с инструкциями в данном видео, как показано здесь для GK 2 дикого типа. На панели слева находится окно с несколькими наложенными друг на друга токами, которые были получены с помощью протокола с линейным изменением напряжения в присутствии различных растворов. Обратите внимание на входящую ректификацию.

Это более выраженный входящий ток при -100 мВ примерно на 50-й миллисекунде на кривой тока. Небольшой выходящий ток в диапазоне от 0 до +40 мВ примерно между 200 и 260 миллисекундами на кривой тока обусловлен работой эндогенного потенциал-зависимого калиевого канала. Это не ток GER T.

Один курсор помещается на пик максимального входящего тока, и значения курсора записываются в таблицу. В таблице отображаются номер записи и величина тока при -100 mV.

Данные включают базальный ток, токи, индуцированные карбахолом и вызванные алкоголем, а также ток, ингибированный барием. Аналогично представлены токи при развертке напряжения в присутствии различных растворов. Для мутантного канала L 2 57 w показаны значения для 20 k плюс 100 millimolar этанола, 20 k плюс five millimolar карбахола или 20 k плюс барий.

Обратите внимание на значительно меньшие токи, индуцированные алкоголем и карбо-алкоголем. Эти результаты позволяют предположить, что данный остаток играет важную роль в гейтинге каналов GK под воздействием алкоголя и субъединиц g beta gamma. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать мутацию в an и начать изучение ее влияния на функцию канала с использованием передовых электрофизиологических методов.

После освоения данного метода сайт-направленного неогенеза процедуру можно проводить за два-три дня и масштабировать до пяти или более мутаций. Разработка этих методов позволила биофизикам ионных каналов исследовать фундаментальные свойства функционирования и гейтинга ионных каналов. Кроме того, они позволяют исследователям изучать заболевания человека, вызванные единичной мутацией в гене ионного канала.