Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений

Здравствуйте, я Раджа Ти, аспирант Института сердца и диабета Baker IDI. Я ознакомлю вас с этапами 3D-иллюстрации модификации Восточного типа, характеризующейся повреждением ДНК и конденсацией хроматина в кардиальной клетке. ДНК обернута вокруг ядерных зон.

Каждая нуклеосома состоит из четырех различных типов гистонов: H2A, H2B, H3 и H4. Образование разрывов ДНК сопровождается фосфорилированием H2AX. Это фосфорилирование H2AX происходит преимущественно в хроматине, который характеризуется метилированием H3K4. Теперь мы рассмотрим 3D-иллюстрацию модификаций в клетке с иммуномаркировкой фосфорилированного H2AX и метилированного H3K4.

Приступим к работе. Для начала поместим часть клеточной суспензии в 15 мл пробирки Falcon; их дважды промывают с помощью PBS, центрифугируя при 50 G, с последующим ресуспендированием.

Перенесите клетки в свежую среду, чтобы пронаблюдать непосредственное влияние облучения на клеточные процессы. Держите клетки на окулярах от пяти до 10 минут до и во время облучения. Подвергните клетки воздействию гамма-излучения или рентгеновских лучей. После облучения распределите по три миллилитра клеточной суспензии в каждую из шести лунок GU.

Планшет для анализа уровней γ-H2AX; инкубируйте клетки от 30 минут до одного часа при 37 °C. Мы используем систему Cytospin для нанесения неадгезивных клеток на предметные стекла. При сборке зажима Cytospin убедитесь, что весь фильтрующий картридж совпадает с воронкой.

Расположите по 50 µL данной клеточной суспензии в каждую лунку, поместите цитоспины в центрифугу и центрифугируйте при 500 RPM в течение пяти минут. Извлеките цитоспины и отделите предметные стекла от фильтрующей карты. Не допускайте слишком длительного высыхания клеток на воздухе, так как это может повлиять на фон при флуоресцентном окрашивании.

Используя жидкий блокирующий стержень, обведите кругом каждый мазок, затем зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение пяти минут. По сравнению с этанолом или ОИ, лучшая фиксация наблюдалась при использовании 4% параформальдегида. Обработайте предметные стекла PPS для пермеабилизации клеток с помощью Triton X 100 при комнатной температуре в течение пяти минут.

По сравнению с twin 80, мы наблюдали более выраженный сигнал в клетках при использовании Triton X 100. Наблюдайте за клетками с PP S3 трижды по пять минут. Блокируйте клетки в 1% BSA в течение 10 минут при комнатной температуре и повторите это три раза; данные условия были выбраны в сравнении с другими блокирующими агентами и временем воздействия.

BSA оказался наиболее эффективным средством для минимизации неспецифического связывания первичных антител; мы использовали два первичных антитела в разведении 1:500 в 1% BSA, нанося примерно по 50 µL первичного антитела на каждый предметное стекло. Инкубация с первичными антителами при комнатной температуре в течение 60 минут снижает фоновое окрашивание по сравнению с инкубацией в течение ночи при 4 °C. Промойте клетки трижды в PBS по пять минут.

Alexa Fluor 488 — хороший антимуссный антитело, а Alexa Fluor 546 — антикроличный. Вторичные антитела использовались для одновременного окрашивания различных маркеров. Используйте антитела, полученные в разных видах животных.

Добавьте примерно 50 µL разведенных вторичных антител на каждый предметный стеклo. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 90 минут. Рекомендуется проводить инкубацию клеток в увлажненной камере, чтобы предотвратить высыхание клеток и антител. Промойте предметные стекла раствором PBS 3 раза по пять минут.

На каждый предметный стеклo добавляли 50 µL разведенного в 500 раз раствора topo three в PBS. Слайды промывали PBS трижды по пять минут. После этого с предметных стекол удаляли излишки влаги и добавляли раствор Antifa.

Рекомендуется не высушивать клетки полностью перед добавлением раствора Antifa. Накройте образец на предметном стекле покровным стеклом. Следует избегать образования пузырьков воздуха.

Оставьте стекла на ночь в темной влажной камере. Закрепите препарат с помощью лака для ногтей, чтобы предотвратить высыхание клеток. Изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа, показывают.

Для получения изображений с более высоким пространственным разрешением использовался гелий-неоновый лазер. Вместо объективов с более высоким или низким увеличением предпочтение было отдано 63-кратному масляному иммерсионному объективу. Коэффициент масштабирования три или четыре позволит получить изображение с лучшим разрешением.

Для количественного анализа FO во многих клетках предпочтительно использовать скорость сканирования 8 и размер изображения 1024 на 1024 пикселя на клетку. При получении изображений для нескольких каналов рекомендуется использовать последовательное линейное сканирование вместо покадрового. Чтобы избежать выгорания образца, усиление детектора и смещение усилителя настраиваются таким образом, чтобы уменьшить шум и насыщение сигнала.

Поскольку размер Kama HX X four может быть меньше 0.5 micrometers, рекомендуется получать изображения с разрешением не менее 0.5 micrometer. Для получения серии изображений вдоль оси струи в режиме jet series pattern необходимо использовать схему mark first и mark lost. Чтобы продемонстрировать пространственную взаимосвязь между различными белками, рекомендуется использовать скорость сканирования six с размером изображения 2048 And 2 48 pixels в режиме metamor first.

Во-вторых, подсчет можно проводить по изображениям, полученным на различных konfokal-микроскопах. Откройте теги изображений gamma hgx либо напрямую через меню файла, либо используя номера счетов (bill numbers). Перейдите в меню «Process» (Обработка) и выберите «Stack arithmetic» (Арифметика стека).

Выберите максимальную проекцию (maximum projection) и укажите плоскости, которые необходимо включить, после чего нажмите «ОК». Затем выберите функцию top hat и в качестве исходного изображения укажите изображение Gamma H2X, после чего примените изменения.

Фильтр «top hat» и полученное в результате изображение будут представлять собой бинарное изображение с меньшим уровнем шума и сниженной вариацией интенсивности фокусов. Перейдите в раздел «regions», выберите инструмент рисования областей (region drawing tool) и обведите ядра. Перейдите в меню «process» и выберите «threshold image».

Выберите порог включения и установите значения нижнего и верхнего пределов. Как правило, именно значения порогов влияют на число четырех. Оптимальным значением порога является то, которое минимизирует включение фона и максимизирует включение объектов исследования.

Наилучшим образом это можно реализовать путем подсчета количества вылазок (foray) с использованием различных пороговых значений. Затем следует сравнить количество вылазок, полученное таким образом, с результатами подсчета на глаз. Выберите DPI-изображение, перейдите в меню «Области» (regions) и выберите опцию «Перенести области» (transfer regions).

Теперь у нас есть соответствующие изображения Foray и ядер, готовые к подсчету. Большинство областей ядер перенесены в Top Hat. Перейдите в меню Measure и выберите Integrated Area Analysis или IMA, выберите Measure all regions и нажмите Measure, чтобы получить число FTE.

Теперь данные о количестве эквивалентов полнозагруженных сотрудников (FTE) по каждому региону можно экспортировать в электронную таблицу с помощью опции «Log data». Откройте ранее созданные изображения с jet-проектора для каждого канала. Перейдите в меню «display» и выберите «color align».

Выберите соответствующие исходные изображения для каждого канала, чтобы создать совмещенное изображение для всех трех каналов. Для иллюстрации пространственного расположения различных маркеров в ядре проводится анализ профиля интенсивности (line scan). Перейдите в командную панель инструментов измерения и выберите «line scan analysis», затем проведите линию через клетку.

Это позволит создать график, отображающий интенсивность флуоресценции каждого канала вдоль линии, что представляет расстояние между различными маркерами относительно друг друга. Чтобы создать 3D-изображение из стека, перейдите в меню «Stack» и выберите «3D reconstruction». В качестве типа 3D-реконструкции выберите «maximum».

Выберите плоскость вращения и задайте расстояние калибровки струи. Обычно пользователь подтверждает выбор нажатием «ОК» для создания 3D-реконструкции. На этом наш протокол иммунофлуоресцентного окрашивания и анализа изображений завершен.

Подводя итог, иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия представляет собой метод трехмерной визуализации различных маркеров C и фокусов gamma H2AX в ядрах клеток. Спасибо за просмотр.