Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений

Здравствуйте, я Раджа Ти, получаю докторскую степень в Институте сердца и диабета Baker IDI. Я расскажу вам о шагах, связанных с 3D-иллюстрацией восточной модификации, которая отметила повреждение ДНК и хроматическую конденсацию в новой сердечной клетке. ДНК окутывает ядерные зоны.

Каждая нуклеосома состоит из четырех различных типов гистонов: H два A, H два b, H три и H четыре ради. Образование ДНК разрывается, и это обозначается PHO H two X. Этот pho H two X происходит в основном в креатине, который характеризуется метилированием H three K four. Теперь мы рассмотрим 3D-иллюстрацию изменений в метке клеточного иммунитета со слоем pho H 2 X и метилированным H Three K 4.

Давайте начнем. Мы начинаем с помещения E курса суспензии клеток в 15 мил. Пробирки Falcon S промываются дважды ароматизатором PB при одной 50 G и Resus.

Приостановите в свежей среде, чтобы увидеть непосредственное влияние излучения на клеточные события. Держите клетки на глазах в течение 5–10 минут до и во время облучения. Подвергайте клетки воздействию гамма-излучения или рентгеновских лучей После облучения нанесите три миллилитра клеточной суспензии в каждую из шести ГУ.

Луночный планшет для пиковой гаммы H два X инкубируют клетки от 30 минут до одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. Мы используем миссию цитозина для размещения неадгезивных клеток на стеклянных предметных стеклах. При сборке зажима для цитозина следите за тем, чтобы весь шнур фильтра совпадал с воронкой.

Дозируйте один 50 микролитров, смойте эту клеточную суспензию В каждый цитозин окончательно поместите цитозин в миссию цитозина и вращайте его со скоростью 500 оборотов в минуту в течение пяти минут. Снимите зажимы с цитозином и отделите предметные стекла от фильтрующей карты. Не оставляйте клетки на воздухе слишком долго, так как это может повлиять на фон при окрашивании флуоресцеином.

С помощью жидкого блокиратора булавкой рисуем круги Вокруг каждого мазка фиксируем ячейки с 4%-ной параформой головки при комнатной температуре на пять минут. По сравнению с этанолом или ол, лучшая фиксация наблюдалась при использовании 4%-ной головки параформа. Wind скользит с ячейками PPS perme с Triton X 100 при комнатной температуре в течение пяти минут.

По сравнению с близнецом 80, мы наблюдали лучший сигнал в клетках с Triton X 100. Наблюдайте за ячейками с PP S3 каждый раз в течение пяти минут. Заблокируйте клетки в одном человеке BSA на 10 минут при комнатной температуре и повторите это три раза по сравнению с другими блокаторами и раз.

Для минимизации неспецифического связывания первичных антител мы использовали два первичных антитела, разбавленных по одному из 500 с 1% БСА в дозе примерно 50 микролитров первичного антитела на каждое стекло. Инкубация первичного антитела при комнатной температуре в течение 60 минут снижает фоновое окрашивание по сравнению с ночной инкубацией при четырех градусах Цельсия. Промойте клетки трижды PBS в течение пяти минут.

Alexa floor 4 88, good anti mouse и Alexa floor 5 46 word anti rabbit. Вторичные антитела использовались для одновременного пребывания разных маркеров. Используйте антитела, выращенные у разных видов.

Добавьте примерно 50 микролитров разведенного вторичного антитела на каждое предметное стекло. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 90 минут. Рекомендуется инкубировать клетки во влажной камере, так как это предотвратит высыхание клеток и антител

На каждый слайд добавляли 50 микролитров одного из 500 разбавления топо три в PBS. Промойте слайды PBS по три раза по пять минут. Удалите лишнюю влагу со слайдов и добавьте раствор Антифа.

Рекомендуется не высушивать клетки полностью перед добавлением раствора Антифа. Наденьте на предметное стекло защитный листок. К следует принимать, чтобы избежать образования каких-либо пузырьков воздуха.

Оставьте предметные стекла на ночь в темной влажной камере. Заклейте предметное стекло лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание клеток. Изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа, показали.

Улучшенное пространственное разрешение ушло, и для получения изображений использовался гелиевый лазер. Объект с выбросами масла 63 имеет две линзы, предпочитаемые линзам с большим или меньшим увеличением. Коэффициент масштабирования в три или четыре раза позволит получить изображение с лучшим разрешением.

Для учета FO из многих ячеек предпочтительно использовать скорость сканирования восемь, размер изображения 1024 на ячейки 1024 пикселя. При визуализации по нескольким каналам рекомендуется последовательное линейное сканирование по сравнению с кадровым сканированием. Чтобы избежать обесцвечивания образцов, усиление детектора и смещение усилителя регулируются таким образом, чтобы уменьшить количество мышей и насыщение сигнала.

Поскольку размер Kama HX X four может быть ниже 0,5 микрометра, рекомендуется получать изображения с точностью не менее 0,5 микрометра. Размер шага по оси струи требуется в шаблоне серии струй с использованием маркера сначала и маркера потерянного шаблона. Чтобы проиллюстрировать пространственные отношения между различными белками, рекомендуется использовать скорость сканирования шесть с размером изображения 2048 пикселей и 2 48 пикселей с использованием метамора.

Второе можно отсчитать по изображениям, полученным на различных конфокальных микроскопах. Открывайте теги изображений Gamma hgx либо прямо из меню файла, либо с помощью номеров счетов. Теги. Перейдите в меню процесса и выберите Stack arithmatic.

Выберите максимальную проекцию и выберите планы, которые будут включены. И нажмите OK. Теперь выберите цилиндр и выберите изображение Gamma H two X в качестве исходного изображения.

Фильтр цилиндра и результирующее изображение будут двоичным изображением с меньшим уровнем шума и уменьшенным изменением интенсивности фокусов. Перейдите в раздел Регионы и выберите инструмент рисования регионов и нарисуйте области вокруг ядер. Переходим в процесс, меню и продаем пороговое изображение.

Выберите порог включения и установите нижнее и верхнее пороговые значения. Обычно именно пороговые значения влияют на четверку. Оптимальным пороговым значением считается то, которое минимизирует включение фона и максимизирует включение фона.

Лучше всего этого можно достичь, подсчитывая количество набегов с использованием различных пороговых значений. А затем сравните число вылазок с подсчетом невооруженным глазом. Выберите изображение DPI и перейдите в меню регионов и выберите опцию передачи регионов.

Теперь у нас есть соответствующие вылазки и ядерные образы, готовые к подсчету. Большая часть ядерных регионов переведена в цилиндр. Перейдите в раздел «Измерение», меню и выберите интегрированный анализ или IMA, выберите «Измерить все регионы» и нажмите «Измерить», чтобы получить номер штатного сотрудника.

Теперь номера FTE из каждого региона могут быть экспортированы в таблицу с помощью опции Log data. Откройте ранее созданные изображения струйного проектора для каждого канала. Перейдите в режим отображения и выберите выравнивание цвета.

Выберите соответствующие исходные изображения для каждого канала, чтобы создать изображение для всех трех каналов. Анализ линейного сканирования выполняется для иллюстрации пространственного расположения различных маркеров в ядре. Перейдите к команде «Измерительные панели инструментов» и выберите «Анализ линии», «Сухая линия» поперек ячейки.

Это создаст график, показывающий интенсивность флуоресценции каждого канала вдоль линии и представляющий расстояние между различными маркерами по отношению друг к другу. Чтобы создать 3D-изображение из стопки, перейдите в меню «Стопка» и выберите пункт «3D-реконструкция». Выберите максимальный тип 3D-реконструкции.

Выберите план вращения, выберите расстояние калибровки струи. Обычно пользователь указывает нажатие кнопки ОК, чтобы создать 3D реконструкцию. На этом мы завершаем наш протокол иммунофлюорографии и окрашивания, а также анализа изображений.

Таким образом, иммунофлуоресцентный конфокальный микроскоп представляет собой два метода для трехмерного визуального отображения различных С-маркеров, а гамма-Н — два Х-фой в ядре клетки. Спасибо за просмотр.